楊麗娜 王恩峰 許卓茂 符景旦 孫軼群

(海南西部中心醫(yī)院整復(fù)燒傷科,海南 儋州 571700)

糖尿病的患病率和發(fā)病率急劇攀升,已成為全球重要公共保健問題之一,糖尿病正嚴(yán)重威脅人們的生命健康,預(yù)計到2045年糖尿病患者人數(shù)將達6.29億,國際糖尿病聯(lián)合會最新發(fā)布《糖尿病地圖》顯示,我國有1.14億糖尿病患者,居世界首位〔1,2〕。糖尿病患者由于長期的血糖、血脂代謝異常,抗氧化能力下降,合并神經(jīng)病變及各種不同程度下肢血管病變及局部組織缺血,是導(dǎo)致潰瘍形成的重要原因,臨床主要表現(xiàn)為潰瘍、感染和壞疽。糖尿病足是截肢的首位原因,糖尿病足患者有 14%～24%需要截肢,約 85%截肢由足潰瘍引發(fā),國外相關(guān)報道每年因糖尿病足所引起的截肢在(5.7～20.5)人/10 萬人,是糖尿病患者致殘、致死的主要原因〔3,4〕。糖尿病足潰瘍和截肢所帶來的醫(yī)療消耗巨大,幾乎相當(dāng)于糖尿病其他并發(fā)癥的總和,所以糖尿病慢性潰瘍治療非常重要。本研究通過動物實驗探討脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)聯(lián)合納米銀凝膠敷料對大鼠糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的影響。

1 資料與方法

1.1實驗儀器 臺式低速離心機(長沙英泰儀器有限公司);倒置顯微鏡〔奧林巴斯(北京)銷售服務(wù)有限公司〕;生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);CO2培養(yǎng)箱(SANYO);電子天平(昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司);血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司);小動物麻醉機(英國Mss);數(shù)碼相機(蘇州富士膠片映像機器有限公司);全波長酶標(biāo)分析儀(北京普天新橋);恒溫?fù)u床(BLabotery);脫水機(DIAPATH);包埋機(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);凍臺(武漢俊杰電子有限公司);組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司),烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司);載玻片(Servicebio);正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康);成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.2實驗材料 Ⅰ型膠原酶購自Biosharp,DMEM/F12(1∶1)、胎牛血清、GlutaMAX(TM)-I(100X)、0.25%胰酶均購自Gibco,檸檬酸、無水乙醇、二甲苯均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,檸檬酸三鈉購自阿拉丁,鏈脲佐菌素(STZ)購自麥克林,血糖試紙購自三諾生物傳感股份有限公司,0.9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司,異氟烷購自上海雅衍信息科技有限公司,Rat轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)KIT、Rat血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA KIT、Rat白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA KIT、Rat腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA KIT均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,環(huán)保型脫蠟透明液購自Servicebio,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio。

1.3實驗動物 清潔級2月齡SD雄性大鼠200只,100只用于建模分組,另100只用于提取脂肪制備脂肪干細(xì)胞,雄性,體質(zhì)量200～250 g,飼養(yǎng)環(huán)境濕度50%～60%,溫度22～24 ℃,光照/暗循環(huán)12 h/12 h,可隨意獲取食物和水。

1.4糖尿病慢性創(chuàng)面大鼠模型建立 實驗用大鼠在實驗前12 h禁食,定量飲水。將1% STZ溶液,以60 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射2 d。間隔48 h,連續(xù)兩次測量,誘導(dǎo)大鼠糖尿病,2 d后動物血糖水平>250 mg/dl、尿糖為(++++)時,表明動物患有糖尿病,即成糖尿病大鼠模型。將糖尿病大鼠用鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉后背部備皮,在脊柱兩側(cè)分別作直徑2 cm的圓形標(biāo)記,面積大約3.14 cm2。在無菌條件下,用外科方法切除標(biāo)記處全層皮膚,止血后用無菌紗布覆蓋,在背部形成2 cm直徑的全層皮膚缺損,用生物膠固定傷口,防止傷口自行愈合,用納米銀水膠體敷料覆蓋創(chuàng)面,繼續(xù)養(yǎng)殖30 d,使其成為糖尿病慢性創(chuàng)面大鼠模型,手術(shù)后注射 4 000 U青霉素鈉防止感染。

1.5動物實驗分組 將糖尿病慢性創(chuàng)面模型大鼠隨機分為9個實驗組和1個對照組各10只,將ADSCs按照1×106、5×106、1×107個細(xì)胞數(shù)與脂肪膠(SVF-gel)混合后外用于慢性創(chuàng)面;同時將ADSCs細(xì)胞按照 5×106個細(xì)胞的量注射在創(chuàng)面周邊皮下。將 ADSCs的不同劑量及處理方式分成9個治療組:A組(創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs),B組(創(chuàng)面涂抹SVF-gel),C組(創(chuàng)面涂抹SVF-gel+1×106ADSCs),D組(創(chuàng)面涂抹SVF-gel+5×106ADSCs),E組(創(chuàng)面涂抹SVF-gel+1×107ADSCs),F組(創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel),G組(創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel+創(chuàng)面涂抹1×106ADSCs),H組(創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel+創(chuàng)面涂抹5×106ADSCs),I組(創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel+創(chuàng)面涂抹1×107ADSCs),另設(shè)1個對照組J組(納米銀凝膠敷料換藥)。治療后,1、2、3 w觀察各組創(chuàng)面面積、愈合率、愈合速率、血清細(xì)胞因子及組織病理分析。 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)大鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同;(2)符合糖尿病慢性潰瘍;(3)對大鼠處置符合醫(yī)學(xué)倫理要求。

1.6脂肪源性干細(xì)胞分離、培養(yǎng) (1)SVF-gel制備:麻醉消毒后,切取100只大鼠腹股溝區(qū)脂肪層獲取脂肪,將獲取的脂肪組織剔除纖維結(jié)締組織,棄掉液體部分備用。將脂肪組織分裝到20 ml注射器中,嚴(yán)格無菌操作,置入離心機中,離心機1 200 r/min離心10 min。提取中間層高密度脂肪組織,將裝有高密度脂肪的無菌注射器與另一只全新的20 ml無菌注射器用內(nèi)徑為2.4 mm柔軟魯爾連接頭密閉連接,兩個互相連接的20 ml注射器形成相對密閉空間,推動注射器活塞(推注速度10 ml/s),將脂肪組織通過切割連接頭在兩個注射器中往返推注20次。使其變成乳糜狀脂肪(Nanofat),剔除結(jié)締組織后入離心機中,設(shè)置參數(shù)為1 600 r/min,離心3 min。用1 600 r/min離心力離心3 min,去除上層油脂及底層紅細(xì)胞等得到中間層即為我們實驗所需的 SVF-gel,其中含有高度濃縮的ADSCs,整個實驗過程堅持無菌原則。 (2)ADSCs單細(xì)胞懸液制備:取制備的脂肪組織,加入體積相等的0.075%Ⅰ型膠原酶,將標(biāo)本置入37 ℃氣浴振蕩器中,予以消化約30 min。消化后的組織400 r/min離心5 min,棄掉上層未完全消化的組織及上清液。 然后磷酸鹽緩沖液(PBS)分次清洗多余的Ⅰ型膠原酶,再次400 r/min離心5 min,棄掉上清液,收集底層細(xì)胞群,PBS 重懸。懸液通過100、70、40 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾,去除未完全消化的纖維結(jié)締組織,形成富含 ADSCs 單細(xì)胞懸液。(3)脂肪來源干細(xì)胞ADSCs體外擴增培養(yǎng):將新鮮分離的細(xì)胞群,按照1×104～2×104個細(xì)胞數(shù)接種在10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的密度及培養(yǎng)基的顏色,隔天更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞爬滿(95%左右)培養(yǎng)皿底部,胰酶消化后繼續(xù)分皿培養(yǎng),直至細(xì)胞達到1×108個,然后無菌分管-80 ℃凍存,備用。

1.7脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與納米銀凝膠敷料生物相容性評估 將納米銀凝膠混入培養(yǎng)基,然后添加脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞進行培養(yǎng)。通過顯微鏡觀察脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的狀態(tài)及生長速度,并用流式細(xì)胞儀檢測脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分化狀態(tài)。

1.8脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞療效及安全性評估 (1)處置前清除膠水,拍照記錄創(chuàng)面情況,用帶有網(wǎng)格的塑料板,每一個方格面積為1 mm2,用網(wǎng)格板測量創(chuàng)面大小精確計算面積。 (2)創(chuàng)面進行徹底清創(chuàng),用生理鹽水反復(fù)清洗創(chuàng)面,將ADSCs懸浮液轉(zhuǎn)入1 ml注射器中,各實驗組采用不同劑量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,均勻涂抹于創(chuàng)面及注射于創(chuàng)面邊緣皮下。 (3)應(yīng)用干細(xì)胞后的創(chuàng)面外用納米銀凝膠敷料包扎。連續(xù)觀察各組1、2、3 w傷口愈合情況,觀察、記錄創(chuàng)面愈合面積和時間并計算愈合率及愈合速率。 (4)創(chuàng)面完全愈合后,處死大鼠,取大鼠創(chuàng)面愈后病理標(biāo)本用10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,做HE染色并于光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察新生組織的形態(tài)、表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管密度、炎性細(xì)胞、膠原沉積等指標(biāo)。 (5)各組預(yù)留2只大鼠長期飼養(yǎng),直至自然死亡或時間大于2年,做細(xì)胞治療安全性評估。

1.9比較不同濃度脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞或以不同種植方式對糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的影響 研究不同處理方式下創(chuàng)面的愈合速度、愈合質(zhì)量及愈合組織顯微鏡下的形態(tài)學(xué)及結(jié)構(gòu)變化。找出最佳愈合給藥濃度或者相同愈合效果最低給藥濃度。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 注射STZ溶液后,給藥前,各組大鼠毛色光滑,體態(tài)、飲食、活動均正常,各組大鼠體重及血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組體質(zhì)量、創(chuàng)面面積、愈合率、愈合速率

2.2各組殘余創(chuàng)面面積 治療后第7、14天,各組間殘余創(chuàng)面面積差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而21 d時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在第7天和第14天,H組殘余創(chuàng)面面積明顯小于其他實驗組及對照組(P<0.05),愈合最佳給藥濃度為:創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel+創(chuàng)面涂抹5×106ADSCs。見表1。

2.3各組創(chuàng)面愈合率 各組創(chuàng)面愈合率在7 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),14 d與21 d組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第7天,H組創(chuàng)面愈合率明顯大于其他實驗組及對照組(P<0.05),愈合最佳給藥濃度為創(chuàng)面皮下注射5×106ADSCs+創(chuàng)面涂抹SVF-gel+創(chuàng)面涂抹5×106ADSCs。見表1、圖1。

圖1 H組創(chuàng)面隨時間遷移愈合情況

2.4各組創(chuàng)面愈合速率 各組創(chuàng)面愈合速率在7、14 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而第21天組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在第7、14天,H組創(chuàng)面愈合速率明顯高于其他實驗組及對照組(P<0.05)。見表1。

2.5各組創(chuàng)面組織病理學(xué)對比 治療后第7、14天,對照組較多炎癥細(xì)胞浸潤,同時有少量毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長;實驗組有較少炎癥細(xì)胞浸潤,有較多毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長。H組與其他實驗組相比,炎癥細(xì)胞浸潤較少,毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長較多。見圖2。

圖2 各組組織病理觀察(HE染色,×400)

3 討 論

糖尿病創(chuàng)面難以愈合的原因與晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)增加、長期慢性炎癥反應(yīng)、周圍神經(jīng)功能障礙等密切相關(guān)〔5〕。缺血、神經(jīng)病變和感染是導(dǎo)致組織壞死和潰瘍形成的 3 個主要因素,局部的高血糖代謝產(chǎn)生的糖脂代謝產(chǎn)物異常的增高,引起血管基底膜的改變,進而形成微血管病〔6〕。血管病變是糖尿病足潰瘍發(fā)生的一個機制,改善局部的血供是治療糖尿病潰瘍的策略之一〔7〕。新生血管的形成是一個復(fù)雜的過程,不僅需要內(nèi)皮細(xì)胞增殖,還需要多種生長因子的作用。糖尿病患者體內(nèi)環(huán)境異常會影響ADSCs的生物學(xué)功能,影響創(chuàng)面愈合〔8〕。再上皮化延遲、炎癥細(xì)胞浸潤及肉芽組織形成減少、血管再生能力降低、膠原分泌減少及膠原化紊亂,涉及血管病變、神經(jīng)病變、感染及局部微環(huán)境異常等,創(chuàng)面局部微環(huán)境異常包括局部高血糖環(huán)境、 氧化應(yīng)激、生長因子及細(xì)胞因子表達異常等〔5,9,10〕。因其發(fā)病機制復(fù)雜、病程較長,治療難度較大,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點、重點及難點。糖尿病創(chuàng)面作為慢性難愈合創(chuàng)面的典型,主要特點為:創(chuàng)面大多比較深,合并感染多見;動脈硬化多見、管壁增厚明顯,肉芽組織脆弱生機低下;瘢痕組織增生,有時骨化發(fā)生;反復(fù)發(fā)作,遷延不愈〔11〕。最常用的方法是嚴(yán)格控制血糖基礎(chǔ)上,徹底清創(chuàng)、負(fù)壓吸引、換藥等治療,創(chuàng)傷大、時間長?；颊咂惹邢Ｍ懈涌焖侔踩行o痛的治療方法,解決糖尿病足慢性潰瘍創(chuàng)面問題,降低截肢概率,提高生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn),來源于脂肪組織中的活性成分-脂肪基質(zhì)血管成分(SVF),包含 ADSCs、內(nèi)皮組織細(xì)胞、血細(xì)胞、T 細(xì)胞、抗炎細(xì)胞等,能夠分泌多種細(xì)胞因子,具有較強的自我更新能力,可分化為各種類型的功能細(xì)胞,具有向內(nèi)皮細(xì)胞表型分化并且有在體內(nèi)參與血管形成的潛能,可以改善局部血液循環(huán),形成有利于組織細(xì)胞存活和功能維持的微環(huán)境,被認(rèn)為是組織再生和修復(fù)的最理想細(xì)胞來源〔12～14〕。ADSCs 在皮膚創(chuàng)傷愈合的干細(xì)胞治療中有巨大潛力,與骨髓來源的干細(xì)胞相比,ADSCs 具有更強的造血和修復(fù)組織能力,其體積小,分化程度低,對創(chuàng)傷和缺氧的耐受力比成熟脂肪細(xì)胞好。脂肪來源的干細(xì)胞自體移植免疫原性低、不涉及倫理問題,被認(rèn)為是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物〔15〕。對糖尿病足缺血組織具有重要的應(yīng)用價值〔16〕。大量研究顯示,ADSCs 在糖尿病潰瘍治療方面具有極大潛力,可通過增加上皮化和肉芽組織形成、抗炎和抗凋亡作用及釋放VEGF及成纖維細(xì)胞因子(FGF),通過旁分泌機制激活成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞,從而促進難愈性創(chuàng)面愈合〔17～20〕。其機制可能與代償升高有關(guān),ADSCs 是安全的,能在體外擴增,具有分化為多種細(xì)胞譜系的能力。ADSCs 治療糖尿病潰瘍患者可增強潰瘍演化,減少疼痛,降低疼痛評分,改善跛行及行走距離,可以促進慢性潰瘍的愈合,需要更多的研究來確定 ADSCs 在治療糖尿病慢性潰瘍中的確切作用,ADSCs 在糖尿病慢性創(chuàng)面細(xì)胞再生治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。在糖尿病足慢性創(chuàng)面的修復(fù)上國內(nèi)外學(xué)者采用了多種技術(shù),取得了較好的效果,有專家用脂肪干細(xì)胞注射治療大鼠慢性創(chuàng)面,或外用都得到了肯定的療效。但也存在患鼠感染死亡率高,模型不穩(wěn)定的情況。雖然有明確的數(shù)據(jù)證實了 ADSCs 對慢性創(chuàng)面的作用,但對使用的量和效果之間的關(guān)系沒有進一步闡述。納米銀凝膠敷料含有一定濃度的銀離子,具有抑菌作用,兼具保濕作用,有利于抑制局部感染改善 ADSCs 的存活環(huán)境〔21〕。本研究結(jié)果提示,經(jīng)ADSCs聯(lián)合納米銀凝膠敷料干預(yù)的實驗組病理結(jié)果可見更少的炎癥細(xì)胞浸潤及更多的纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管生長。其中以H組皮下注射與外用涂抹給藥聯(lián)合外涂SVF-gel效果最佳,并得出了最佳給藥濃度。

綜上,利用納米銀凝膠敷料保濕、抗菌的作用,并用SVF-gel混合改善慢性創(chuàng)面局部 ADSCs 生長環(huán)境,促進 ADSCs 存活,可提高 ADSCs 對慢性創(chuàng)面的治療效果。