陸永莉 李輝 王文彪,

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453000; 2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種多種因素引起的、以關(guān)節(jié)軟骨變性破壞為主要特征的慢性、進展性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病率、致殘率高,是導(dǎo)致老年人殘疾和生活質(zhì)量下降的主要原因〔1～3〕。目前,KOA病因及發(fā)病機制尚不完全清楚,多認(rèn)為與力學(xué)因素和生物學(xué)因素的相互作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨的合成與降解失衡〔4～7〕,使膝關(guān)節(jié)周圍肌力下降、關(guān)節(jié)失穩(wěn)和疼痛三者之間形成惡性循環(huán)有關(guān)〔8〕。運動療法作為物理治療中應(yīng)用最廣泛的方法,不僅有助于阻斷這種惡性循環(huán),減緩關(guān)節(jié)軟骨損害,還能提高關(guān)節(jié)穩(wěn)定性,改善關(guān)節(jié)功能,減輕疼痛程度和活動受限〔9～11〕,提高患者膝關(guān)節(jié)活動能力和生活質(zhì)量〔12,13〕,在臨床應(yīng)用中效果顯著。手術(shù)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎(OA)動物模型的證據(jù)也表明中度運動可以延遲軟骨退化的進展〔1〕。但目前研究多傾向于主動運動,忽略了被動運動對KOA的影響,關(guān)于被動運動的基礎(chǔ)實驗研究更是少見。

因此,本研究旨在從大鼠KOA模型角度驗證被動運動治療KOA的有效性,觀察被動運動對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨白細(xì)胞介素(IL)-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13表達(dá)的影響,探討被動運動治療KOA的機制,以期更好服務(wù)于臨床,為臨床康復(fù)治療KOA提供新的治療思路和治療方法。

1 材料和方法

1.1實驗動物 2～3月齡的健康雌性SD大鼠30只,體質(zhì)量(300±30)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機選取10只作為空白組,其余20只采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法制備KOA大鼠模型,并于造模完成后隨機選取10只造模大鼠作為被動運動組,給予被動運動干預(yù),剩余10只為模型組。實驗動物質(zhì)量合格證號:1107261911005590,實驗動物使用許可證號:SCXK(魯)20190003。本實驗于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)研究中心進行,實驗操作均符合新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理委員會的要求。

1.2模型制備 采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法造?！?4～18〕:在無菌條件下用0.9%氯化鈉溶液配制6%(W/V)木瓜蛋白酶溶液和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液,儲存于4 ℃冰箱,于實驗前4 h取出室溫放置,注射前30 min將6%的木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的 L-半胱氨酸溶液按2∶1的比例混勻。將模型組和被動運動組腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉成功后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約45 °,從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)膝眼向髁間窩方向進針,明顯有落空感后,針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm,注入6%木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸的混合溶液0.30 ml至右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔。左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔用同樣方法注射0.30 ml 生理鹽水作為對照。實驗開始后的第4、7天分別再注射1次。在注射完成后標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)大鼠28 d,模型造模完成。在造模完成后1 w,隨機抽取每組大鼠各2只處死,以檢驗造模成功與否。

1.3被動運動干預(yù) 戴上皮質(zhì)捕鼠手套,用大拇指和食指固定大鼠頸部,食指和中指固定大鼠腹部,小指固定大鼠尾巴,剛好暴露大鼠四肢,且不影響其活動。然后另一手拉出大鼠右后肢,抓住大鼠趾部,使其與脊柱呈45 °并向后外方牽拉,直至大鼠右后肢完全伸直(膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)完全伸直),然后再向與牽拉方向相反的方向,將大鼠右后肢推向身體使之完全屈曲緊貼身體(膝關(guān)節(jié)完全屈曲,踝關(guān)節(jié)完全背曲),如此一個往復(fù)為一個周期。大鼠右后肢被動運動施加頻率為一天2次,每次不少于3 min,大鼠每側(cè)后肢每天共活動600個周期。整個過程中要動作輕柔,速度適中,全關(guān)節(jié)幅度活動,運動持續(xù)時間4 w〔19～21〕。

1.4標(biāo)本獲取 將大鼠過量麻醉處死,仰位固定并打開右膝關(guān)節(jié)腔,分離前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶,截取大鼠膝關(guān)節(jié)股骨端附帶少量軟骨下骨作為標(biāo)本,去除周圍軟組織,4%中性甲醛固定24 h,脫鈣完成后進行石蠟包埋,制成組織切片備用。

1.5主要觀察指標(biāo)

1.5.1造模后一般情況觀察 肉眼觀察造模完成后每組大鼠的飲食、飲水、精神狀態(tài)、毛色的光澤度、自由活動情況等。

1.5.2大體觀察 解剖各組處死大鼠,充分暴露大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié),觀察各組關(guān)節(jié)軟骨表面是否光滑、有無糜爛及潰瘍、色澤和透明度變化、有無纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等〔22〕。

1.5.3關(guān)節(jié)液的采集及IL-1β含量檢測 吸取0.2 ml生理鹽水于注射器中,沿關(guān)節(jié)間隙注射入關(guān)節(jié)腔,再回抽出生理鹽水與滑膜液的混合液,如此反復(fù)抽吸3次,收集抽取的液體,-80 ℃冰箱保存〔23〕。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)按照試劑盒嚴(yán)格操作檢測IL-1β含量。

1.5.4軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin評分 組織連續(xù)切片4～6 μm,分別行蘇木素-伊紅(HE)染色、甲苯胺藍(lán)染色及番紅O-固綠染色,熒光顯微鏡下觀察軟骨組織形態(tài)、細(xì)胞簇集及排列是否整齊、基質(zhì)染色、軟骨表面裂隙及纖維化等情況。每個樣本分別于內(nèi)、外側(cè)各取3張切片,測量軟骨表面至潮線表面厚度并對病理學(xué)切片進行Mankin評分〔24〕。

1.5.5軟骨細(xì)胞中MMP-13表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法,將連續(xù)切片置于烤片機上烤片1 h,脫蠟及水化后抗原修復(fù)30 min,滅活組織切片中的內(nèi)源性過氧化物酶和生物素,牛血清白蛋白封閉1 h,加一抗4 ℃孵育過夜,回收一抗,加二抗室溫孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,晾干封片后光鏡下觀察,用ImageG軟件進行細(xì)胞計數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1造模后一般情況 造模后大鼠較之前精神萎靡,飲食、飲水及活動量減少,毛色暗淡,注射側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹,活動時注射側(cè)肢體著地減少。

2.2大體觀察 正常組關(guān)節(jié)軟骨透明度好,呈灰白色,軟骨表面光滑;模型組關(guān)節(jié)軟骨透明度差,顏色變暗,軟骨層變薄,軟骨表面不光滑,關(guān)節(jié)滑液明顯增多;被動運動組軟骨色澤較模型組明顯改善,軟骨層增厚,關(guān)節(jié)滑液減少。 見圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨大體觀察

2.3軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察軟骨組織標(biāo)本,HE染色見正常組軟骨細(xì)胞排列整齊,層次分明;模型組軟骨細(xì)胞明顯減少,排列紊亂,出現(xiàn)裂隙;被動運動組軟骨細(xì)胞較模型組增多,排列稍整齊,層次較清楚。甲苯胺藍(lán)染色和番紅O固綠染色見正常組軟骨基質(zhì)染色深且均勻,軟骨各層清楚可辨,潮線連續(xù)完整;模型組軟骨基質(zhì)染色弱且不均,軟骨層變薄,潮線不清;被動運動組較模型組明顯改善,軟骨基質(zhì)染色加深,軟骨層增厚,潮線較清楚。見圖2。

圖2 各組軟骨組織形態(tài)學(xué)及軟骨細(xì)胞中MMP-13表達(dá)(DAB,×400)

2.4各組Mankin評分比較 模型組Mankin評分〔(7.7±0.948 68)分〕最高,被動運動組〔(4.3±0.948 68)分〕明顯低于模型組、明顯高于正常組〔(0.2±0.421 64)分〕,各組間比較差異顯著(P<0.05)。

2.5各組IL-1β含量和MMP-13表達(dá)比較 與正常組比較,模型組及被動運動組IL-1β含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,被動運動組IL-1β含量明顯降低(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色可見陽性細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均著棕黃色。與正常組比較,模型組及被動運動組MMP-13表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,被動運動組MMP-13表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組IL-1β含量和MMP-13表達(dá)比較

3 討 論

KOA主要病理學(xué)改變是關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、軟骨下骨反應(yīng)性增生和骨贅形成〔25〕。KOA的一個顯著特征是關(guān)節(jié)軟骨的進行性退化,研究表明,軟骨細(xì)胞賴以生存的細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡是導(dǎo)致軟骨退變的重要原因之一,軟骨基質(zhì)的降解和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生對KOA的病理進展至關(guān)重要〔26〕。運動療法是目前KOA治療中公認(rèn)的有效方法,有研究表明,運動療法能在提高KOA患者關(guān)節(jié)活動度的同時,減輕疼痛并改善膝關(guān)節(jié)功能,使76%的患者免于關(guān)節(jié)置換手術(shù)〔27〕。國外也早在2001年就提出將運動療法作為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的首選〔28〕。但目前有關(guān)被動運動的基礎(chǔ)研究甚少,其作用機制也不明確。

本研究采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法制備KOA大鼠模型,木瓜蛋白酶誘導(dǎo)KOA成功率高、時間短、重復(fù)性好〔29〕,對膠原蛋白和軟骨細(xì)胞沒有直接影響,只通過對細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖影響來破壞膠原蛋白的整合〔14〕,因此可以形成與人類KOA相似的病變。本實驗中,注射木瓜蛋白酶4 w后,即可見軟骨細(xì)胞的減少和排列紊亂,與人類早期KOA一致。本實驗結(jié)果表明,被動運動對KOA大鼠具有一定的治療作用,可以改善關(guān)節(jié)軟骨的退變與破壞,能夠在一定程度上促進關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。

MMPs是軟骨基質(zhì)降解中最重要的酶之一〔30〕。MMP-13是靶向軟骨降解的主要酶,與其他 MMP 相比,MMP-13 的表達(dá)更局限于結(jié)締組織,在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨和Ⅱ型膠原蛋白降解中發(fā)揮重要作用〔31〕。本實驗表明,被動運動可以抑制關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-13表達(dá),使關(guān)節(jié)軟骨的降解減少,對關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護作用。

炎性因子在KOA的發(fā)生和發(fā)展過程中也起著重要作用,它們參與了膝關(guān)節(jié)的新陳代謝,對于維持膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重大影響,其中IL-1β被認(rèn)為是導(dǎo)致KOA產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,其可以獨立誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和軟骨分解,也可以和其他介質(zhì)一同發(fā)揮致炎作用〔32〕。有研究表明,IL-1β能通過抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖及細(xì)胞增殖影響關(guān)節(jié)軟骨的退變〔31〕。本實驗表明,被動運動可以通過降低關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1β含量來減輕炎癥,改善KOA大鼠癥狀。

綜上,被動運動可通過降低KOA大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β含量減輕炎癥反應(yīng);抑制軟骨細(xì)胞中MMP-13表達(dá),可減少軟骨基質(zhì)降解,促進關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)。關(guān)于具體的治療機制,有待進一步研究。