任美穎 金燕 樊思軒 舒麗莎

(河北北方學(xué)院 1第一臨床醫(yī)學(xué)院,河北 張家口 075000;2附屬第一醫(yī)院婦科)

目前宮頸癌的被關(guān)注度越來(lái)越高,已成為全球女性惡性腫瘤第4位。根據(jù)癌癥報(bào)告指示,在2020年全球新發(fā)宮頸癌病例超過(guò)60萬(wàn),其中死亡病例超過(guò)30萬(wàn),嚴(yán)重威脅女性健康〔1〕。近年來(lái),隨著人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗的預(yù)防性接種、HPV感染篩查的逐漸普及、宮頸癌早期診治方面的極大改善,盡管在發(fā)達(dá)地區(qū)其發(fā)病率和病死率有所下降,但是在經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)仍呈上升趨勢(shì)〔2〕。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸病變發(fā)生的主要病因,此外,癌基因的激活或抑癌基因的缺失對(duì)宮頸病變發(fā)展成癌的過(guò)程亦起關(guān)鍵作用〔3〕。因此,闡明宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,研發(fā)宮頸癌靶向治療的新型標(biāo)記分子至關(guān)重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA是非編碼RNA的子集,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平均發(fā)揮作用,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分子生物學(xué)功能,獲得增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力。UC001kfo是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA,可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等多種途徑參與肝癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的進(jìn)展〔4,5〕。目前關(guān)于UC001kfo在宮頸癌中的作用機(jī)制仍不明確,為此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UC001kfo在宮頸癌細(xì)胞系HeLa中的表達(dá)水平,研究UC001kfo對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為宮頸癌分子靶向治療提供方向。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 人宮頸上皮永生化細(xì)胞株H8購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);人宮頸癌細(xì)胞株HeLa由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、青鏈霉素合劑、0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)于上海ExCellBio公司;LipofectamineTM3000購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司;質(zhì)粒、siRNA由蘇州吉瑪公司構(gòu)建;引物均由生工生物工程公司合成;Trnzol、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購(gòu)自北京天根生化公司;CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體均購(gòu)自北京博奧森公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)H8細(xì)胞,DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞,在37 ℃、5%CO2飽和溫度條件下常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且融合至85%左右,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,傳代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4RT-PCR檢測(cè)UC001kfo在H8和HeLa細(xì)胞中表達(dá)水平 所有操作佩戴手套、口罩和帽子,在消毒滅菌后的超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,使用RNase-free的槍頭和EP管以防RNA快速降解。提前選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的2種細(xì)胞種板,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育,待細(xì)胞密度達(dá)85%左右,TRNzol裂解細(xì)胞后提取總RNA,用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度、純度。參照PCR試劑說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以cDNA為模板,在95 ℃預(yù)變性3 min×1,95 ℃變性5 s,60 ℃退火/延伸31 s×40的條件下行PCR擴(kuò)增,引物序列:UC001kfo正向引物:5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′,反向:5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′;α-SMA正向引物:5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′,反向:5′-GATTCGTCGTCCTGAGAAGTCG-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正向引物:5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′,反向:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。采用 2-ΔΔCt方法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞,參照LipofectamineTM3000說(shuō)明書分別將siUC001kfo.1、siUC001kfo.2、siUC001kfo.3、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-Vector及3種不同劑量LipofectamineTM3000的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,構(gòu)建空白對(duì)照組、pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo和siRNA-NC組。TRNzol裂解細(xì)胞并提取總RNA,RT-PCR分析UC001kfo的轉(zhuǎn)染效率,擇上調(diào)效果及干擾效果最佳轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6CCK-8檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖力 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的5組HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)并接種于96孔板,各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞融合至80%左右,分別待細(xì)胞培養(yǎng)至12、24、36、48、72 h后于每孔各加10 μl CCK-8溶液,混勻后再孵育2 h,用Fisherbrand測(cè)各孔細(xì)胞450 nm處光密度(OD)值。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移率 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5組HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)后接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至95%左右,用10 μl槍頭在每孔各劃3條豎線,線段貫穿培養(yǎng)板整個(gè)孔,盡量保持各孔線段寬度一致。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片,每孔各加2 ml完全培養(yǎng)基,在倒置顯微鏡下拍照記錄并將其作為0 h細(xì)胞遷移狀況圖予以保存。分別孵育至24、48、72 h后測(cè)量劃痕寬度并記錄。

1.8Transwell檢測(cè)HeLa細(xì)胞侵襲 將Matrigel膠置于4 ℃冰箱中液化,用DMEM維持液按1∶3稀釋,每孔各加60 μl Matrigel膠稀釋液迅速鋪至預(yù)冷的Transwell小室內(nèi),覆蓋聚碳酯膜,于37 ℃孵育1 h,使Matrigel膠凝固。5組細(xì)胞用DMEM維持液饑餓12 h后,胰酶消化并離心,細(xì)胞計(jì)數(shù)為(1～5)×107個(gè)/L,每孔200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell上室;Transwell下室吸800 μl完全培養(yǎng)基。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基,用棉簽輕輕擦拭Matrigel膠,4%多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min?；赥ranswell上下室的營(yíng)養(yǎng)成分不同,通過(guò)趨化作用,待風(fēng)干后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲能力后拍照記錄。

1.9RT-PCR檢測(cè)UC001kfo與α-SMA的表達(dá)相關(guān)性 提前將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5組HeLa細(xì)胞接種于6孔板,于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞融合至50%進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48 h后提總RNA,檢測(cè)RNA濃度和純度。PCR步驟同前,引物序列見(jiàn)1.4,采用 2-ΔΔCt方法分析α-SMA相對(duì)表達(dá)量。

1.10Weatern印跡分析蛋白表達(dá) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的6組〔pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3+siα-SMA及空白對(duì)照組〕HeLa細(xì)胞,并提取蛋白。以GAPDH為內(nèi)參,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;一抗4 ℃孵育過(guò)夜;二抗室溫孵育2 h;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色,AI600上機(jī)檢測(cè)條帶并保存圖像,ImageJ分析并計(jì)算灰度值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件分析數(shù)據(jù);GraphPad Prism5軟件繪圖。組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析,組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1UC001kfo在宮頸癌HeLa細(xì)胞中顯著高表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示,與H8細(xì)胞(1.001 7±0.072)相比,HeLa細(xì)胞中LncRNA UC001kfo表達(dá)水平(2.2219±0.153)顯著升高(t=12.466,P<0.01)。

2.2確定轉(zhuǎn)染效率 與siRNA-NC組(0.998±0.499)和空白對(duì)照組LncRNA UC001kfo表達(dá)水平(0.995±0.035)相比,siUC001kfo.1組(0.009±0.000 6)、siUC001kfo.2組(0.005±0.000 3)、siUC001kfo.3組中UC001kfo表達(dá)水平(0.007±0.000 3)明顯降低,以siUC001kfo.2組降低更顯著(F=1 187.404,P<0.05)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取siUC001kfo.2轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞沉默UC001kfo表達(dá)。與pCDNA3.1(+)-Vector組(1.036±0.132)和空白對(duì)照組(1.018±0.033)LncRNA UC001kfo表達(dá)水平相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.1組(8.366±0.062)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.2組(11.051±0.083)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組中UC001kfo表達(dá)水平(24.091±0.262)明顯升高,以pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組升高最顯著(F=13 972.672,P<0.05)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞來(lái)上調(diào)UC001kfo的表達(dá)。

2.3上調(diào)UC001kfo表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同時(shí)間pCDNA3.1(+)-Vector組、空白對(duì)照組和siRNA-NC組增殖活力大致相同;與pCDNA3.1(+)-Vector組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組OD值在各時(shí)間段均顯著增高(P<0.05),說(shuō)明上調(diào)UC001kfo的表達(dá)可促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖力,且在72 h促進(jìn)效果更顯著;相反,siRNA-UC001kfo.2組在各時(shí)間段的OD值均顯著低于siRNA-NC組(P<0.05),說(shuō)明沉默UC001kfo的表達(dá)抑制其增殖力,且在72 h抑制效果較佳。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間UC001kfo對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活力的影響

2.4上調(diào)UC001kfo表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)UC001kfo表達(dá)促進(jìn)了Hela細(xì)胞的遷移能力;相反,沉默UC001kfo表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用。與pCDNA3.1(+)-Vector組和空白對(duì)照組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組在細(xì)胞孵育24、48和96 h時(shí)劃痕面積愈合百分比明顯增高,且96 h較48 h促進(jìn)效果更明顯(P<0.05);相反,與siRNA-NC組和空白對(duì)照組相比,siRNA-UC001kfo.2組細(xì)胞劃痕寬度顯著減小,且96 h較48 h抑制效果更顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組劃痕24、48和96 h遷移率及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5上調(diào)UC001kfo表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)UC001kfo表達(dá)促進(jìn)了宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲;相反,沉默UC001kfo表達(dá)抑制了宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲。與空白對(duì)照組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目〔(341.333±27.301)個(gè)/視野〕相比,pCDNA3.1(+)-Vector組〔(477.333±52.814)個(gè)/視野〕和siRNA-NC組〔(337.000±30.806)個(gè)/視野〕從上室穿過(guò)多孔膜至下室的細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著改變(P>0.05);與pCDNA3.1(+)-Vector組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組〔(1 814.333±143.040)個(gè)/視野〕單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多;相反,與siRNA-NC組相比,siUC001kfo.2組〔(189.000±11.000)個(gè)/視野〕單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(F=267.743,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.6UC001kfo與α-SMA mRNA在HeLa細(xì)胞中呈正相關(guān) RT-PCR結(jié)果顯示,pCDNA3.1(+)-Vector組(1.089±0.167)、空白對(duì)照組(1.008±0.150)和siRNA-NC組中α-SMA mRNA(1.002±0.164)無(wú)顯著差異(P>0.05)。與pCDNA3.1(+)-Vector組和空白對(duì)照組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組α-SMA mRNA表達(dá)(2.682±0.020)顯著升高;與siRNA-NC組和空白對(duì)照組相比,siUC001kfo.2組α-SMA mRNA表達(dá)(0.304±0.052)顯著降低(F=143.533,P<0.05)。

2.7UC001kfo影響HeLa細(xì)胞EMT Western印跡顯示,與空白對(duì)照組及pCDNA3.1(+)-Vector組比較,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高, E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與空白對(duì)照組及siRNA-NC組比較, siUC001kfo.2組Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低,E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。pCDNA3.1(+)-Vector組、siRNA-NC組和空白對(duì)照組Vimentin、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明UC001kfo對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞EMT過(guò)程具有促進(jìn)作用。見(jiàn)表2、圖3。

1～5:pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組、pCDNA3.1(+)-Vector組、空白對(duì)照組、siRNA-NC組、siUC001kfo.2組圖3 UC001kfo影響Hela細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

宮頸癌是生殖系統(tǒng)好發(fā)的惡性腫瘤,高發(fā)人群越來(lái)越趨于年輕化〔6〕,有近99.7%已確診宮頸癌患者患有HPV感染〔7〕,在輔助因素中,低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、高生育率、多個(gè)性伴侶等均與宮頸癌的危險(xiǎn)因素有顯著相關(guān)性〔8,9〕,此外,基因表達(dá)紊亂也起關(guān)鍵調(diào)控作用〔3〕。早期宮頸癌臨床治療效果較好,晚期宮頸癌預(yù)后較差,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是病死的重要原因〔10〕,故以基因水平為出發(fā)點(diǎn),研發(fā)新型用于宮頸癌診治的臨床生物標(biāo)志物,使分子靶向治療在臨床上得到進(jìn)一步完善。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA的子集,缺乏保守的開(kāi)放閱讀框架,不能編碼蛋白質(zhì)〔11〕,研究顯示,lncRNA參與許多生物學(xué)和病理過(guò)程并發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控角色〔12〕。惡性腫瘤細(xì)胞的形成伴有大量基因紊亂,除了蛋白質(zhì)編碼基因外,lncRNA也通過(guò)抑癌或促癌途徑參與眾多惡性腫瘤的進(jìn)展〔13〕。UC001kfo是Pan等〔14〕從肝癌組織中篩選出來(lái)的一種lncRNA,該基因位于染色體Chr10(q3.31),共2 043 bp,通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UC001kfo在肝癌中顯著高表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。與之相反,UC001kfo在乳腺癌中起抑癌作用,其原因可能與不同腫瘤細(xì)胞所處微環(huán)境不同有關(guān)〔4〕。因此本研究推測(cè),UC001kfo也可能通過(guò)抑癌或致癌途徑參與宮頸癌進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)UC001kfo可能在宮頸癌進(jìn)展中起促癌作用,可能促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。

α-SMA是一種參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和維護(hù)的肌動(dòng)蛋白,也是參與細(xì)胞骨架的主要成分之一。α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的肌纖維母細(xì)胞能分泌基質(zhì)蛋白和尿凝血酶原激活物、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ等細(xì)胞因子,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)〔15〕,UC001kfo和α-SMA在染色體上存在部分重疊位點(diǎn)。本研究也通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證這一結(jié)論,在轉(zhuǎn)染48 h后的各組HeLa細(xì)胞中,UC001kfo與α-SMA的表達(dá)量呈正相關(guān)。α-SMA參與EMT過(guò)程,腫瘤細(xì)胞能穿透基底膜到達(dá)間質(zhì),完成EMT過(guò)程,經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移至其他臟器,對(duì)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及進(jìn)展起關(guān)鍵作用〔16〕。在此過(guò)程中,上皮細(xì)胞極性喪失,遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),同時(shí)上皮表型丟失而逐漸獲得間質(zhì)表型。伴隨表型變化,許多基因的表達(dá)發(fā)生了改變,上皮表型相關(guān)蛋白如E-cadherin下降,間質(zhì)表型相關(guān)蛋白如Vimentin、α-SMA等含量上升,同時(shí)一系列轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)也發(fā)生變化。本研究提示,UC001kfo對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的EMT過(guò)程具有促進(jìn)作用。

綜上所述,UC001kfo在宮頸癌HeLa細(xì)胞中顯著高表達(dá),能促進(jìn)HeLa細(xì)胞的EMT過(guò)程,從而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此UC001kfo可能在宮頸癌的進(jìn)展中發(fā)揮促癌的調(diào)控角色,可能是新型用于宮頸癌診治的臨床生物標(biāo)志物,為進(jìn)一步完善分子靶向治療提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外,關(guān)于UCOO1kfo與α-SMA的協(xié)同關(guān)系及調(diào)控途徑仍需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究,今后我們將繼續(xù)以此展開(kāi)實(shí)驗(yàn)研究,提供治療宮頸癌更有效的憑據(jù)。