殷金成 劉洪新 顧燕青 唐新宇 郭宗保 沈儉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院,上海 202150)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率以男性居多,其發(fā)病率和死亡率隨著年齡的增長而逐漸升高,在因癌癥死亡人群中所占比例為2.1%〔1〕。盡管治療技術(shù)不斷進(jìn)步,但仍有約40%非肌肉浸潤性膀胱癌患者在5年后進(jìn)展為肌肉浸潤性膀胱癌,且5年生存率只有60%〔2〕。膀胱癌的高復(fù)發(fā)率和死亡率是有待解決的臨床問題,目前臨床上的藥物治療效果不盡理想,且毒副作用較多〔3〕。三葉青是一種具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效的中草藥,且有抗腫瘤和保肝效果,其塊莖內(nèi)含有的黃酮類化合物稱為三葉青總黃酮(TFTH),具有抗腫瘤活性。有研究認(rèn)為TFTH可通過信號通路誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡〔4〕。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3來源于胞質(zhì)蛋白家族,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的雙重效應(yīng),其持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞的自發(fā)性生長和細(xì)胞惡性〔5〕。本研究探討TFTH對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響及其對STAT3信號通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1TFTH的提取 選擇三葉青塊根2 000 g,通過堿性稀醇提取法〔6,7〕得到三葉青總黃酮10 g,聚酰胺層析后,乙醇洗脫后真空干燥,取樣品2 mg,加入20 μl二甲基亞砜(DMSO)使其充分溶解,制備得1.0×105mg/L的儲備液,-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。使用時可用完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度。

1.2膀胱癌細(xì)胞 人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87購自南京海克爾生物科技有限公司(從美國ATCC細(xì)胞庫引進(jìn))。使用DMEM培養(yǎng)基,包括10%胎牛血清(FBS)、1%A-A(100 U/ml青霉素-100 U/ml鏈霉素),放在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,細(xì)胞生長至80%左右時傳代培養(yǎng),傳至第三代用于以下試驗(yàn)。

1.3細(xì)胞對數(shù)試劑盒(CCK)8試驗(yàn) 使用CCK8(美國,MCE)檢測TFTH對癌細(xì)胞增殖的影響,BIU-87細(xì)胞生長到80%融合時胰酶消化、計(jì)數(shù)、重懸,將細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋至密度1×104個/ml。根據(jù)加入的TFTH稀釋液濃度(0、20、50、100 μg/ml),分成4組,每組設(shè)5個復(fù)孔,同時設(shè)置參照孔(培養(yǎng)基、藥物),分別將細(xì)胞懸液100 μl/孔種入96孔板中,細(xì)胞貼壁后,加入相應(yīng)濃度的TFTH,放于孵箱中培養(yǎng)24、48 h后,取出每孔添加10 μl CCK8試劑,繼續(xù)孵育1 h,取出于酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度(OD)值,用實(shí)驗(yàn)組OD值減去空白組OD值得出最終OD值,重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡檢測 分別用不同濃度TFTH處理BIU-87細(xì)胞后,置于預(yù)冷的組織培養(yǎng)液中,并用雙蒸水清洗。將300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上,將BIU-87細(xì)胞液放在網(wǎng)上,邊搓邊以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,直至將細(xì)胞液搓完。收集細(xì)胞懸液,500 r/min離心后棄其上清,并用生理鹽水洗兩次,BIU-87細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)不少于1×106個/L細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液100 μl至1.5 ml EP管中,加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ/碘化丙啶(FITC) 5 μl和20 μg/ml PI溶液10 μl,孵育15 min,加入PBS 400 μl,流式細(xì)胞儀檢測。

1.5Western印跡檢測Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)2、STAT3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X基因(Bax)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1蛋白表達(dá) 收集不同濃度TFTH處理24 h后的BIU-87細(xì)胞,用RIPA蛋白裂解液適量提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白,參照碧云天試劑盒說明配制10%濃度的膠,每孔道加總蛋白40 μg,100 V恒壓電泳2 h,蛋白分離后在100 V恒壓下轉(zhuǎn)膜1.5 h,轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉室溫條件封閉1 h,將膜與一抗(均按照1∶1 000稀釋的JAK2、STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1抗體),4 ℃孵育過夜,洗膜,室溫孵育辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗1 h,洗膜,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,磷酸甘油醛脫氧酶(GAPDH)蛋白為內(nèi)參,ImageJ軟件分析各蛋白與內(nèi)參的灰度值比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度TFTH組對BIU-87細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示,20、50、100 μg/ml的TFTH處理BIU-87細(xì)胞24或48 h后,對癌細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)。見表1。

表1 不同濃度TFTH對BIU-87細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2不同濃度TFTH對BIU-87細(xì)胞凋亡的影響 20、50、100 μg/ml的TFTH處理BIU-87細(xì)胞24或48 h后,均有明顯誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用(P<0.01)。見表1。

2.3各組JAK2、STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá) 經(jīng)20、50、100 μg/ml TFTH處理后BIU-87細(xì)胞,其JAK2、STAT3、VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯降低,Bax蛋白表達(dá)明顯升高,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖1。

1～4:0 μg/ml組、20 μg/ml組、50 μg/ml組、100 μg/ml組圖1 Western印跡檢測各組蛋白表達(dá)

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤,其病因復(fù)雜,與環(huán)境因素、遺傳因素、接觸芳香胺、吸煙等因素均有關(guān)。目前的臨床治療手段主要以手術(shù)和化療為主,但治療效果常不理想,術(shù)后復(fù)發(fā)率高。TFTH是中草藥中的黃酮類化合物,其功效可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔8〕。有研究報(bào)道,TFTH可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡〔9〕;此外還有研究認(rèn)為人肝癌HepG2細(xì)胞S期可被TFTH阻滯并具有誘導(dǎo)凋亡的作用〔10〕。JAK2/STAT3信號通路是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的重要途徑,參與細(xì)胞多個生理過程,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔11〕。已有研究發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT3信號通路參與前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞的增殖和凋亡,在癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色〔12,13〕。本研究結(jié)果顯示,不同TFTH (20、50、100 μg/ml)濃度對BIU-87 細(xì)胞進(jìn)行處理后,有明顯抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,且隨著TFTH濃度升高效果越明顯。

JAKs、STATs 家族在各類細(xì)胞和組織中廣泛分布,JAK2/STAT3信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡方面具有重要作用,其異?；罨瘯鸺?xì)胞增殖過快、過多和惡變〔13〕。Western印跡表明,不同濃度TFTH明顯抑制膀胱癌細(xì)胞內(nèi)JAK2和STAT3表達(dá)水平,并與劑量濃度相關(guān),因此通過抑制STAT3表達(dá)有望開發(fā)成為治療膀胱癌的新靶點(diǎn)〔14,15〕。

有研究表明,腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展與TGF-β1、VEGF有關(guān),TGF-β1、VEGF表達(dá)升高可抑制免疫細(xì)胞的增殖,有助于膀胱癌細(xì)胞的免疫逃逸〔16〕。此外,STAT3和Snail-Smad3/TGF-β1信號通路協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移或侵襲,而AG490 具有抑制 STAT3 磷酸化、降低p-Smad3蛋白水平從而減少肝癌細(xì)胞遷移或侵襲的作用,逆轉(zhuǎn)免疫抑制〔17〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),TFTH具有相似的功效,能顯著抑制STAT3、TGF-β1、VEGF在膀胱癌細(xì)胞BIU-87中的表達(dá),因此可增強(qiáng)機(jī)體對癌細(xì)胞的免疫反應(yīng),從而抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax是Bcl-2的家族成員之一,其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究顯示,膀胱癌細(xì)胞的凋亡與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/Bcl-2/Bax信號通路表達(dá)有關(guān),上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-xL、Bcl-2表達(dá)可誘導(dǎo)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡〔18,19〕。本研究結(jié)果顯示,TFTH能有效提高Bax蛋白表達(dá)水平,從而誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細(xì)胞的凋亡?？傊?JAK2/STAT3信號通路的活化異常參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,引起細(xì)胞與組織的惡變,出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡異常、細(xì)胞周期失控、免疫逃避、侵襲轉(zhuǎn)移等〔20〕。因此,以JAK2/STAT3信號通路作為靶位治療膀胱癌有廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)的不足在于對TFTH的作用研究還處于體外試驗(yàn)階段,需要體內(nèi)試驗(yàn)來驗(yàn)證本研究結(jié)果。