周暢 王埮 許葉 趙振強(qiáng) 張海英 馬媛媛 陳志斌

(1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,海南 ?？?570102;2海南醫(yī)學(xué)院;3海南熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

帕金森病(PD)是由于中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致分泌至紋狀體區(qū)多巴胺不足所引起的一系列癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔1〕。目前主要的治療藥物是外源性補(bǔ)充多巴胺或通過激活多巴胺受體來改善PD癥狀,多巴胺主要通過作用于紋狀體的中棘神經(jīng)元的多巴胺受體參與運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控,其中表達(dá)多巴胺2受體(D2R)的神經(jīng)元所介導(dǎo)的間接通路對運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)十分重要〔2〕。D2R下游通路調(diào)節(jié)存在功能選擇偏向性,其功能和調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜。大多數(shù)條件下D2R激動(dòng)后通過G蛋白介導(dǎo)的信號通路引起下級信號級聯(lián)反應(yīng),但當(dāng)G蛋白耦聯(lián)受體激酶(GRK)2升高時(shí)D2R偏向于通過與β-抑制蛋白結(jié)合介導(dǎo)信號傳遞〔3〕。GRK2在多種組織中表達(dá),并參與許多細(xì)胞和生理過程。GRK2參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活機(jī)制調(diào)節(jié),其上調(diào)或下調(diào)與多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),如心血管疾病、糖尿病、腫瘤〔4～7〕。但是截至目前,GRK2在PD發(fā)病過程中扮演何種角色尚不清楚,本文使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)制備慢性PD小鼠模型,探究紋狀體D2R和GRK2蛋白表達(dá)情況,為進(jìn)一步探討GRK2在PD發(fā)病中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)小鼠 20只雄性SPF級C57BL/6小鼠,體質(zhì)量(20.75±0.86)g,約8周齡,由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。在室溫(22±2)℃和相對濕度為(60±2)%的環(huán)境中飼養(yǎng),12～12 h人工晝夜節(jié)律,小鼠自由飲水和取食。

1.2主要材料和儀器 MPTP購自美國Sigma公司;兔抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔抗體購自英國Abcam公司;兔抗D2R抗體購自美國博士德生物公司;兔抗GRK2購自美國GeneTex 公司;苯甲基磺氟(PMSF)、RIPA蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物試劑盒購自中國biosharp公司;Millipore的聚偏氟乙烯(PVDF)膜;全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)使用上海tanon科技有限公司;小鼠曠場實(shí)驗(yàn)軌跡分析儀器購自上海欣軟信息科技有限公司;自制小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)器材。

1.3分組和模型制備 20只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為兩組,每組10只,PD模型組小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg(MPTP配成3 mg/ml濃度溶液備用),對照組腹腔注射0.2 ml等體積生理鹽水,2次/w,共5 w,共10次。MPTP腹腔注射給藥結(jié)束后,對所有小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測,評估運(yùn)動(dòng)功能和焦慮行為。

1.4曠場實(shí)驗(yàn) 將小鼠單獨(dú)放置在場地中央由白色亞克力板構(gòu)成的露天場地(45 cm×45 cm×40 cm),正上方放置攝像機(jī)使用視頻跟蹤軟件(Smart3.0)分析記錄,分析儀自動(dòng)分析小鼠行為軌跡,包括活動(dòng)總距離、穿越中心格次數(shù)和距離,每只小鼠觀察5 min。為消除前只小鼠殘留氣味的影響,兩次實(shí)驗(yàn)間用 75%酒精和水清潔。

1.5爬桿實(shí)驗(yàn) 自制長50 cm、直徑1 cm的木桿頂端放置直徑2.5 cm泡沫小球,木桿表面用紗布纏繞。正式實(shí)驗(yàn)開始前對小鼠進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性訓(xùn)練,將小鼠頭朝上放在球頂端,記錄小鼠雙前肢接觸平臺(tái)的時(shí)間。重復(fù)3次,取平均值,每次實(shí)驗(yàn)間隔大于1 min。若本次實(shí)驗(yàn)小鼠中途停頓或調(diào)轉(zhuǎn)方向則此次結(jié)果不計(jì)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和Western印跡檢測 小鼠麻醉后眼球取血,冰上取黑質(zhì)和紋狀體,液氮速凍后放-80 ℃保存。精確稱取腦組織后按比例放入PMSF、RIPA后勻漿器研磨、超聲裂解,冰上搖床15 min,4 ℃離心15 min,提取上清液,得到總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度(中國碧云天)。取血清和中腦黑質(zhì)蛋白提取物進(jìn)行ELISA檢測,具體步驟參照試劑盒(購自英國Abcam公司)。紋狀體提取總蛋白按比例加入上樣蛋白緩沖液,煮沸4 min。每孔加入40 μg蛋白,8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),PVDF轉(zhuǎn)膜90 min,常溫封閉,一抗(抗TH抗體、抗GRK2抗體、抗D2R抗體)孵育過夜,次日Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜后室溫孵育二抗90 min后顯影。采用ImageJ進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.7免疫組化 小鼠5 %水合氯醛麻醉后冰生理鹽水和多聚甲醛溶液灌注后取腦,多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋分別制備中腦黑質(zhì)和紋狀體部位蠟塊。石蠟切片厚度約5 μm,經(jīng)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、血清封閉等步驟后,一抗(抗TH抗體、抗GRK2抗體、抗D2R抗體)4 ℃孵育過夜,二抗常溫孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明后封片(期間避免干片)。顯微鏡下觀察染色情況,采用ImageJ進(jìn)行平均光密度(AOD)值測量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),GraphPad prism8和Adobe illustrator軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1MPTP影響運(yùn)動(dòng)功能和焦慮行為 在曠場實(shí)驗(yàn)中,與對照組比較,模型組自發(fā)活動(dòng)總距離、穿越中心格次數(shù)和距離明顯減少(P<0.001)。在爬桿實(shí)驗(yàn)中,模型組爬桿時(shí)間比對照組明顯延長(P<0.001)。見表1。

表1 兩組曠場實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)比較

2.2MPTP降低血清和中腦TH酶含量 ELISA結(jié)果顯示,與對照組(166.17±2.50、203.81±3.30)比較,模型組血清及中腦TH值(149.12±2.95、156.38±4.54)顯著降低(均P<0.001)。黑質(zhì)部位組化圖譜可見,與對照組(0.56±0.20)相比,模型組多巴胺神經(jīng)元TH染色變淺,通過ImageJ得出AOD值(0.42±0.42)顯著降低(t=5.81,P= 0.003)。見圖1。

圖1 兩組TH、D2R及GRK2免疫組化

2.3MPTP減少小鼠紋狀體D2R表達(dá) Western印跡顯示,模型組紋狀體D2R表達(dá)較對照組顯著減少(P<0.05);免疫組化顯示,模型組紋狀體D2R的AOD值較對照組顯著降低(P<0.001)。見圖1、圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測兩組D2R及GRK2蛋白表達(dá)

表2 兩組D2R及GRK2表達(dá)比較

2.4MPTP增加紋狀體GRK2蛋白表達(dá) Western印跡顯示,模型組紋狀體GRK2蛋白表達(dá)較對照組明顯增高(P<0.05);免疫組化顯示,模型組紋狀體GRK2的AOD值較對照組明顯增高(P<0.001)。見圖1、圖2、表2。

3 討 論

PD是一種同時(shí)累及運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其累及的人口數(shù)量隨年齡的增加成倍增長,在 45～54 歲的人群中男性和女性的患病率均不到 1%,而在 85 歲以上的人群中男性和女性的患病率分別為4%和2%〔8〕。多巴胺能神經(jīng)元的丟失是目前公認(rèn)的病理標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)失衡是引起臨床癥狀的重要原因〔9〕。研究表明,多巴胺信號主要通過D1R和D2R傳遞信號,其中在紋狀體表達(dá)D1R的中棘神經(jīng)元參與的信號傳導(dǎo)通路又稱為直接通路,促進(jìn)恰當(dāng)?shù)男袨椤⒘?xí)慣;表達(dá)D2R的神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)的通路又稱為間接通路,主要抑制不恰當(dāng)?shù)男袨?、?xí)慣〔10～12〕。在PD狀態(tài)下多巴胺對兩種通路的選擇是存在偏倚的〔13〕。PD的發(fā)病與多種信號通路相關(guān),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜至今尚未闡明,目前的治療主要是補(bǔ)充腦內(nèi)多巴胺的不足及針對D2R的激動(dòng)劑來改善PD患者臨床癥狀〔14〕,因此進(jìn)一步研究D2R相關(guān)通路是今后的重點(diǎn)。

PD多以肌強(qiáng)直、姿勢異常、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等為主要運(yùn)動(dòng)功能障礙伴或不伴焦慮、抑郁、嗅覺減退等非運(yùn)動(dòng)癥狀〔15〕。研究表明,MPTP可針對性的損害多巴胺能神經(jīng)元的線粒體導(dǎo)致出現(xiàn)哺乳動(dòng)物出現(xiàn)類PD的癥狀,其誘導(dǎo)的慢性PD動(dòng)物模型除運(yùn)動(dòng)癥狀外還伴隨著焦慮等非運(yùn)動(dòng)癥狀,與人類PD的運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀一致〔16,17〕。本研究使用MPTP誘導(dǎo)的慢性PD小鼠模型,能更好地反映PD的臨床癥狀和信號通路的改變。

模型通過行為學(xué)和病理學(xué)兩種方式來驗(yàn)證。行為學(xué)方面,曠場實(shí)驗(yàn)和爬桿實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示,模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能受損,慢性PD模型小鼠存在焦慮行為〔18,19〕。本研究發(fā)現(xiàn),慢性PD模型小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間較正常組長。以上行為學(xué)發(fā)現(xiàn)表明,慢性MPTP腹腔注射的臨床表現(xiàn)與PD癥狀相似。從病理學(xué)角度觀察,中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失是目前公認(rèn)的PD病理標(biāo)準(zhǔn),其中TH是合成多巴胺的限速酶,TH的水平與多巴胺能神經(jīng)元功能密切相關(guān)內(nèi)容,TH表達(dá)下降是PD模型診斷的標(biāo)準(zhǔn)〔20〕。本研究結(jié)果顯示,模型小鼠血清和腦內(nèi)TH表達(dá)明顯減少。從臨床表現(xiàn)和病理學(xué)兩方面證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)成功制備慢性PD小鼠模型。

神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺是通過D2R發(fā)出信號,D2R是Gi/o蛋白耦聯(lián)受體,在整個(gè)大腦中廣泛表達(dá)以控制一系列行為,包括運(yùn)動(dòng)、動(dòng)機(jī)、動(dòng)作選擇和獎(jiǎng)懲機(jī)制〔21〕。紋狀體D2R對運(yùn)動(dòng)輸出非常重要,間接通路中棘神經(jīng)元D2R的缺失會(huì)以特定任務(wù)的方式損害運(yùn)動(dòng)活動(dòng),間接通路中棘神經(jīng)元D2R調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)和突觸傳遞,影響自我發(fā)起行動(dòng)的能力及執(zhí)行這些反應(yīng)的意愿和(或)活力。D2R的喪失可能導(dǎo)致多巴胺信號傳導(dǎo)受損,從而引起運(yùn)動(dòng)功能減退或特定自愿行為的啟動(dòng)受損〔2〕。以上表明中棘神經(jīng)元D2R的缺失與人類PD運(yùn)動(dòng)癥狀運(yùn)動(dòng)功能減退、啟動(dòng)困難相似。D2R可通過激活G蛋白通路抑制高電壓激活鈣離子電泳(HVA Ca2+,在PD大鼠紋狀體中表達(dá))〔22〕、鈉漏離子通道電流D2R(NALCN)〔21〕、內(nèi)向整流鉀電流〔23〕降低神經(jīng)元興奮性,調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)行為。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)除G蛋白信號通路外,D2R可通過招募β-抑制蛋白介導(dǎo)受體內(nèi)化、降解,D2R與β-抑制蛋白結(jié)合是運(yùn)動(dòng)必需,并且D2R偏向與β-抑制蛋白結(jié)合可抑制小鼠依賴多巴胺誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)〔24〕。G 蛋白和 β-抑制蛋白在D2R信號通路傳導(dǎo)中是單獨(dú)存在的,且在不同的條件下存在選擇偏倚〔25〕。綜上,D2R與β-抑制蛋白的結(jié)合可阻止D2R-G蛋白下游信號通路的傳導(dǎo)進(jìn)而參與運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控,而如何調(diào)控D2R通路的選擇是治療帕金森病的關(guān)鍵。本文通過Western印跡和免疫組化發(fā)現(xiàn)模型組小鼠紋狀體D2R存在丟失,與既往文獻(xiàn)〔22〕報(bào)道相符。在PD狀態(tài)下紋狀體多巴胺含量減少,D2R表達(dá)減少,如何更好地使多巴胺與D2R結(jié)合,更多的選擇通過G蛋白傳遞信號而不是通過招募β-抑制蛋白傳遞信號傳導(dǎo)是研究的重點(diǎn)。

D2R可直接招募β-抑制蛋白介導(dǎo)受體內(nèi)化,但這種招募與GRK2水平相關(guān),只有在高水平GRK2的情況下才能促進(jìn)β-抑制蛋白的招募,而在低水平GRK2的情況下表現(xiàn)為抑制β-抑制蛋白的招募〔26〕。GRK2磷酸化D2R,使其偏向信號β-抑制蛋白〔27〕。在PD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)紋狀體內(nèi)GRK2升高,而紋狀體內(nèi)D2R表達(dá)減少,綜上推測GRK2升高使D2R偏向與β-抑制蛋白結(jié)合導(dǎo)致D2R表達(dá)減少,并影響D2R-G蛋白信號通路傳遞。對于D2R-G蛋白通路和β-抑制蛋白通路如何選擇及其在PD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。目前所知D2R在正常和PD狀態(tài)下其數(shù)量和功能的變化至關(guān)重要,然而D2R在PD狀態(tài)下的功能變化目前尚未完全清楚,針對D2R信號通路的研究是研究PD發(fā)病機(jī)制的重要,針對性靶向GRK2可能會(huì)調(diào)節(jié)D2R功能變化引起的PD運(yùn)動(dòng)功能障礙。