陳鈺 林敏 陳雅婷 董穎 白婧 劉傳斌 李泱

(1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院,福建 福州 350101;2福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院;3福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院心內(nèi)科;4解放軍總醫(yī)院心血管病學部)

心房顫動(房顫)是臨床上比較常見的心律失常之一。房顫的預后和復發(fā)率均較高,而且存在多種并發(fā)癥。在細胞水平的基礎研究中,房顫的發(fā)生機制均以離子通道電流的改變?yōu)榛A〔1〕。而鉀離子電流是心房復極的主要電流之一,在房顫的發(fā)生和發(fā)展過程中將發(fā)生不同程度的改變,也是誘發(fā)房顫發(fā)生發(fā)展的重要電重構(gòu)基礎〔2〕。臨床上阻滯鉀離子通道的藥物對于房顫的治療起到一定作用,可能其單一阻滯離子流導致治療效果一直不理想。為了更好地減少房顫的發(fā)生,尋找新的多種離子流共同阻滯的藥物尤為必要。

大蒜素為百合科植物大蒜鱗莖中獲得的一種活性成分。已有研究顯示,大蒜素可以抑制心肌收縮和抗心律失常〔3〕,其可減少心肌細胞鈣離子內(nèi)流和鈉電流〔4〕。大蒜素可通過調(diào)節(jié)多種離子通道發(fā)揮改善心律失常的作用,同時對心肌肥厚也有治療作用〔5〕。有研究證實,對小鼠心室肌細胞鉀電流大蒜素呈現(xiàn)出抑制效果〔6〕。大蒜素可使大鼠的心房肌細胞超速激活延遲整流鉀電流發(fā)生改變,提示了對于房顫的治療該成分可能存在一定的潛力。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展使得小鼠被越來越多地應用于各類研究,尤其是在心律失常發(fā)病特點及機制等方面。小鼠心房肌細胞膜上存在多種亞型的鉀通道,性質(zhì)也較為復雜?？偼庀蜮涬娏?IK,peak)、瞬時外向鉀電流(Ito)和超極化激活的延遲整流鉀電流(IKUr)等外向鉀電流也常?；旌显谝黄?不易分離,有效地分離各鉀通道電流對于探討其在動作電位中的貢獻和藥物作用十分有利。而且以往的研究主要針對單一電流發(fā)揮作用,但電流的作用往往是相互聯(lián)合的,藥物對多種電流的效應研究更具有藥理意義。本研究采用全細胞膜片鉗技術(shù)探討大蒜素對小鼠心房肌細胞外向鉀電流IK,peak、Ito和IKUr的效應及可能的作用機制,希望為治療房顫的新藥研究與開發(fā)提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1溶液與試劑 臺氏液組成:氯化鈉(NaCl) 135 mmol/L、氯化鉀(KCl) 5.4 mmol/L、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.33 mmol/L,氯化鈣(CaCl2)1.8 mmol/L,氯化鎂(MgCl2) 1.0 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 10 mmol/L,用氫氧化鈉(NaOH)將pH值調(diào)節(jié)至7.3。0.2 mmol/L Ca2+的臺氏液為臺氏液中加入0.2 mmol/L CaCl2,無鈣臺氏液為臺氏液中不加入CaCl2。細胞貯存液(KB液)組成:氫氧化鉀(KOH) 110 mmol/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)10 mmol/L、?；撬?0 mmol/L、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA) 5,KCl 25 mmol/L、草酸10 mmol/L、谷氨酸70 mmol/L、HEPES 5 mmol/L、Glucose 10 mmol/L,pH值用KOH調(diào)節(jié)到7.4。 用于鉀電流記錄的細胞外液組成:CaCl20.6 mmol/L、MgCl25 mmol/L,N-甲基-D-葡萄糖胺149 mmol/L,HEPES 5 mmol/L,用氯化氫(HCl)調(diào)節(jié)pH值達到7.4。用于鉀電流記錄的細胞內(nèi)液:天冬氨酸鉀85 mmol/L、KCl 45 mmol/L、三磷酸腺苷鎂(MgATP) 5.0 mmol/L、丙酮酸鈉5 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、用KOH調(diào)pH值至7.4。

蛋白酶E、膠原酶、CaCl2、氯化鎘(CdCl2)、天門冬氨酸鉀、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、HEPES、MgATP、4-氨基吡啶(4-AP)及河豚毒(TTX)均購自Sigma公司;EGTA購于Fluka Biochemika公司,其他試劑均為分析純。

1.2小鼠心房肌細胞分離及分組 昆明小鼠〔體質(zhì)量(20±1.5)g,雌雄皆有〕購于解放軍總醫(yī)院動物實驗中心〔合格證號:SCXK(字)2015-2018〕,腹腔注射100 IU/ml肝素,采用頸椎脫臼法將小鼠處死。開胸后迅速取出小鼠心臟并放置于無鈣Tyrode中,在顯微鏡下操作,快速逆行插管至主動脈處,隨后快速將心臟固定在灌流裝置上。先用不加入鈣Tyrode以2.5 ml/min速度灌流5 min,再用50 ml含有膠原酶 0.12 g(效價為280～300 U/mg)、牛血清白蛋白12.5 mg和蛋白酶E 6.0 mg的Tyrode灌流12～15 min。剪去小鼠心室部分,沿房室間溝取下心房部分,放入含有2.5 mg/ml 膠原酶的無鈣Tyrode中,接著消化近5 min,用塑料滴管輕柔抽吸并吹打,分散成單個細胞后轉(zhuǎn)移至預先用層黏連蛋白處理的培養(yǎng)皿上,保持37 ℃、5% CO2,培養(yǎng)至細胞貼壁。通過倒置顯微鏡觀察,實驗過程中選擇表面無顆粒、邊緣較整齊、無收縮的長梭形細胞,并記錄其電流情況。將實驗中消化分離得到的細胞分成對照組及大蒜素組。采用局部灌流裝置以恒流將空白的細胞外液灌流于對照組細胞外,大蒜素組以恒流灌流方式給予30 μmol/L大蒜素。

1.3藥物的應用 大蒜素(含量≥98%,CAS:539-86-6)購自上海禾風制藥有限公司,呈無色或淡黃色油狀物,其相對分子質(zhì)量是162。臨用前采用細胞外液配制成所需終濃度。

1.4心房肌細胞電流的記錄 電流采用全細胞膜片鉗方法記錄,并確保在電壓鉗制模式下完成。首先將計算機與膜片鉗放大器Axon-700B(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)進行連接。由軟件(pCLAMP10.4)控制來采集電壓輸入信號和刺激信號,Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)操作完成。玻璃微電極利用pp-83微電極拉制儀(Narishige Co.Japan)進行拉制,達到入液電阻為2.0～5.0 MΩ、尖端內(nèi)徑為1.0～2.0 μm為宜。將玻璃微電極慢慢接近心房肌細胞并形成高阻抗封接,當封接電阻達到1 GΩ以上時,用負壓吸附脈沖法打破心房肌細胞膜最終形成全細胞記錄模式。將刺激參數(shù)設置為0.4 V/s,電流則按Cm=I/(dV/dt)方程式計算(其中Cm是膜電容,dV/dt是電壓斜率,I是電流值)測定細胞膜的電容。電流值均采用電流密度(pA/pF)的形式表示,以消除細胞與細胞之間造成的誤差。信號的采集應用低頻3 kHz和高頻10 kHz進行濾波。慢電容的補償為85%～90%以此來消除由于膜電容的充放電帶來的影響。

1.5參數(shù)設置IK,peak:設置鉗制電位在-40 mV,-40～+50 mV去極化刺激,給予500 ms,進而產(chǎn)生一個快速的激活電流。

Ito:于細胞外液加入100 μmol/L 4-AP。將鉗制電位設置在-40 mV,給予一個500 ms,-40～+50 mV去極化刺激,從而將電流誘發(fā)出來。該電流可以被2 mmol/L的4-AP阻斷,確定為Ito。

Ito穩(wěn)態(tài)激活曲線:保持電位在-40 mV,先給予-40 mV,20 ms的預刺激,再施加予500 ms,階躍為10 mV,從-70 mV～+50 mV系列去極化刺激后,歸一化各電壓下的電流,用相對電流對膜電位作圖,從而得到穩(wěn)態(tài)激活曲線,利用Boltzmann方程式I/Imax=1/{1 + exp〔(Vm-V1/2)/k〕}進行曲線的擬合,得出激活曲線斜率(Kact)與半激活電壓(V1/2,act)。

Ito穩(wěn)態(tài)失活曲線:保持電位-70 mV,施予1 000 ms,階躍設置為5 mV,從-90 mV～+20 mV的系列去極化刺激,且在每一個條件刺激后施予一個測試刺激+50 mV,300 ms,歸一化各電流幅值,用相對電流對膜電位作圖,從而獲得出穩(wěn)態(tài)失活曲線,利用Boltzmann方程式I/Imax=1/{1+exp〔-(Vm-V1/2)/k〕}擬合曲線,獲得半失活電壓(V1/2,inact)與失活曲線斜率(kinact)。

Ito關閉態(tài)失活時間常數(shù):設定鉗制電位在-110 mV,給加+50 mV,300 ms的條件刺激,恢復至-110 mV,再于-65 mV,5、10、25、50、100、200、400、800和1 600 ms不同時間間隔后,給予一個+50 mV,300 ms的測試刺激,以單項指數(shù)式I=A×exp(-t/τ)求解出Ito關閉態(tài)失活時間常數(shù)。

Ito失活后恢復曲線:鉗制電位設置在-40 mV,給予+50 mV,300 ms去極化刺激,再恢復到-80 mV,在40、80、160、320、640、1 280、2 560和5 120 ms的時間間隔后,再施加第2次測試刺激,參數(shù)為+50 mV,300 ms,將第2次所引出的電流與預刺激電流相比較,利用單項指數(shù)式算出恢復時間常數(shù)。

IKUr:鉗制電位設置在-80 mV,給予500 ms,-40～+50 mV去極化刺激,將IK,peak誘發(fā)出來,利用電流減除法來將此電流減除Ito,最后得到IKUr電流。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大蒜素對小鼠心房肌細胞IK,peak的作用 在+50 mV時,大蒜素組電流峰值密度〔(36.3±3.4)pA/pF〕顯著低于對照組〔(57.2±4.5)pA/pF;n=10,t=4.972,P<0.001〕,見圖1。

圖1 大蒜素對小鼠心房肌細胞IK,peak的影響

2.2大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito電流密度的影響 大蒜素組與對照組相比較,Ito的電流密度明顯降低〔(14.1±2.2) vs (25.0±1.6)pA/pF,n=10,t=5.327,P<0.001〕,且抑制效應隨著藥物劑量的增加更加明顯。進一步,在不同濃度(1.0、3.0、10.0、30.0、100.0 μmol/L)的大蒜素阻滯作用下,Ito呈現(xiàn)濃度依賴性,其中半數(shù)抑制量(IC50)為(21.0±3.8)μmol/L,希爾系數(shù)為0.98,見圖2。

A.大蒜素對電流影響的原始記錄圖; B.大蒜素對電流阻滯的濃度依賴性特征;C.大蒜素對電流阻滯的電壓依賴性特征圖2 大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito的作用

2.3大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito作用的電壓依賴性 小鼠心房肌細胞Ito電流大約在-10 mV刺激時被激活,隨著刺激脈沖呈現(xiàn)出向去極化方向移動趨勢,外向整流特征較為明顯,見圖2。大蒜素組電流密度在各個電壓下均顯著降低,尤其在+20 mV以上,電流密度的降低隨著刺激電壓的增加更加顯著,由此表明,大蒜素對Ito的阻滯效應呈現(xiàn)出電壓依賴性的特征。

2.4大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活的作用 大蒜素組心房肌細胞Ito的穩(wěn)態(tài)激活曲線向右移動,半激活電壓(V1/2act)和激活曲線斜率(kact)稍有變化。大蒜素對通道的穩(wěn)態(tài)激活過程有輕微的減慢作用可能對抑制通道電流的效應有影響。大蒜素組Ito穩(wěn)態(tài)失活曲線向左移動,其半失活電壓(V1/2,inact)與對照組〔(-42.5±3.1)mV〕比較移到(-63.7±2.6)mV,差異有統(tǒng)計學意義(n=10,t=6.898,P<0.001),對照組失活曲線斜率(kinact)為(17.5±1.1)mV,大蒜素組為(15.6±1.7)mV,沒有顯著性差異(t=1.259,P>0.05),見圖3。

A.大蒜素對電流穩(wěn)態(tài)失活過程作用的原始記錄圖;B.大蒜素對電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響圖3 大蒜素對Ito穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用

2.5大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito關閉態(tài)失活的作用 與對照組〔(57.62±5.22)ms〕比較,大蒜素組關閉態(tài)失活時間常數(shù)縮短,但差異無統(tǒng)計學意義〔(52.36±4.54)ms,t=1.020,P>0.05〕,大蒜素對Ito通道的關閉態(tài)失活時間參數(shù)影響不大。顯示了大蒜素對通道電流的抑制作用主要與穩(wěn)態(tài)失活過程有關,而與通道的關閉態(tài)失活過程關系不大,見圖4。

圖4 大蒜素對Ito電流關閉態(tài)失活的影響

2.6大蒜素對小鼠心房肌細胞Ito失活后恢復曲線的影響 從圖5可看出,大蒜素組心房肌細胞Ito的失活后恢復過程顯著減慢,恢復時間常數(shù)(τ)明顯延長,與對照組〔(304.8±15.7)ms〕比較延長至〔(573.3±18.2) ms,n=10;t=14.987,P<0.001〕,恢復曲線向右移動明顯,顯示Ito通道的失活后恢復過程減慢。

A.大蒜素對電流失活后恢復作用的原始記錄圖;B.大蒜素對電流失活后恢復時間常數(shù)作用的電壓依賴性圖5 大蒜素對Ito失活后恢復曲線的作用

2.7大蒜素對小鼠心房肌細胞IKUr的作用 在+50 mV,與對照組比較,大蒜素組峰值密度從(25.8±3.5)pA/pF顯著降低為(18.1±1.9)pA/pF(n=10,t=2.595,P<0.05),見圖6。

圖6 大蒜素對小鼠心房肌細胞IKUr電流的影響

3 討 論

房顫的發(fā)生與發(fā)展原因眾多、機制復雜,僅從單個離子流的作用將很難完整地解釋其發(fā)生發(fā)展的機制,治療也很難達到理想的效果。因此,尋找同時作用于多種電流的藥物將是今后一個新的研究方向〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)別隱品堿可降低小鼠心房肌細胞T-型鈣電流密度,推測該藥物在房顫的發(fā)生和治療等方面有作用〔8〕。研究顯示,大蒜素可以通過多種信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮其對心血管疾病的治療作用〔9～11〕,也有研究其發(fā)揮治療作用的分子機制〔12〕,可見大蒜素有很好的研究開發(fā)前景。

研究發(fā)現(xiàn),大蒜素可有效阻滯IK,peak電流可能是通過抑制小鼠心房肌細胞上IKUr和Ito電流密度,這種多電流同時阻滯的效應將對延長2相和3相動作電位復極有更好的作用,此效應對于誘發(fā)房顫的早后除極和微折返可能有較好的抑制作用,進而對減緩房顫的發(fā)生可能有一定的影響。本研究發(fā)現(xiàn),大蒜素降低Ito電流密度的作用呈現(xiàn)出電壓依賴性特征,即藥物作用隨著去極化電壓的升高而增強。大蒜素的抑制效應還表現(xiàn)出濃度依賴性,其中半數(shù)抑制量(IC50)為(21.0±3.8)μmol/L,此濃度僅為藥物直接作用于細胞的劑量,若在動物整體水平,還需進一步研究驗證,然而,此劑量可作為重要參考。

本研究結(jié)果表明,在相同的去極化電壓之下,通道的穩(wěn)態(tài)失活更多。大蒜素可以延緩Ito通道失活狀態(tài)下的恢復過程,通道失活后再次開放所需的時間延長。由此推斷,大蒜素通過影響Ito通道的穩(wěn)態(tài)失活及失活后恢復動力學的過程來降低Ito電流密度。大蒜素可能主要作用于開放態(tài)通道,即大蒜素可能在通道開放時與通道分子結(jié)合,改變了通道的空間構(gòu)象,進而降低對K+的透過〔13〕。但藥物究竟與通道大分子的結(jié)合域定位還需進一步機制還有待探討。

本研究未能檢測小鼠心房肌細胞鉀離子通道分子的表達情況,無法判斷大蒜素是否對離子通道的基因和蛋白的合成、多種β亞基調(diào)控及細胞膜分布有影響〔14,15〕。故本實驗僅從細胞電生理水平展示藥物的效果及從通道門控動力學角度揭示藥物作用的機制,難以從分子層面揭示藥物的作用基礎。另外,實驗若能直接觀察藥物對動物房顫模型的作用,記錄大蒜素對房顫發(fā)生率的效應,將更有說服力。

本實驗結(jié)果揭示,大蒜素對小鼠心房肌細胞多種鉀電流有阻滯效應,推測該藥物對減少房顫發(fā)生和維持等方面有著治療作用,希望通過進一步的實驗研究使其成為治療房顫的新藥物。