張?jiān)略?王君明,2 崔瑛

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046;2呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心)

雷公藤紅素為衛(wèi)矛科雷公藤屬及南蛇藤屬植物(如雷公藤、南蛇藤、昆明山海棠)中所含的一個(gè)重要的三萜類化合物〔1,2〕,具有抑制肺癌、食管癌、乳腺癌等廣譜抗癌活性〔3～5〕。槲皮素為金錢草、枸杞子、菟絲子、淫羊藿等中藥所含的一個(gè)重要黃酮類化合物〔6～10〕,具有保肝、保腎、改善前列腺炎等廣泛的生物活性〔11～14〕。同時(shí)含有雷公藤紅素與槲皮素這兩個(gè)單體物質(zhì)可共見于一些臨床制劑如昆仙膠囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子、淫羊藿組成),也可見于減毒增效的現(xiàn)代研究如復(fù)方雷公藤湯〔16〕(含雷公藤與金錢草)。本文前期已證實(shí)了含有這兩個(gè)單體成分的雷公藤與金錢草飲片配伍對(duì)高危害性的肺癌、食管癌均有抗癌增效作用〔17,18〕。本研究首次從成分配伍層面,考察雷公藤紅素聯(lián)合槲皮素對(duì)肺癌和食管癌的抗癌增效作用,為雷公藤紅素與槲皮素的科學(xué)合理聯(lián)用提供初步的臨床前實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株A549、食管癌細(xì)胞株Eca9706均由河南中醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試藥 雷公藤紅素購于上海金穗生物科技有限公司,純度≥98%(HPLC),批號(hào):131106;槲皮素購于上海金穗生物科技有限公司,純度≥98%(HPLC),批號(hào):K121228。RPMI1640(Gibco公司);胎牛血清(HyClone公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Amresco公司);二甲基亞砜(DMSO,Amresco公司);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)含酚紅(Solarbio公司)。

1.3主要儀器 酶標(biāo)儀(BioTek ELx800uv);紫外分光光度計(jì)(BioMate);Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Kendro);倒置顯微鏡(ZESS);SG-603生物安全柜(Bake);Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)(Millipore);3-18K高速冷凍離心機(jī)(Sigma);TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XK96-B渦流混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);BS210S型電子天平(北京塞多利斯天平有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱,每間隔48 h更 換1次培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞用消化液(0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶以1∶1比例配制)進(jìn)行消化,并接種于96孔板中。

1.5MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞以1×104/孔接種96孔培養(yǎng)板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設(shè)對(duì)照組、不同濃度雷公藤紅素(0.25、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L)組及不同濃度雷公藤紅素與槲皮素配伍組。參考研究〔19〕,槲皮素對(duì)A549、Eca9706細(xì)胞的IC30值分別為82.7、104.8 μmol/L。每組3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,去除培養(yǎng)上清,每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸去上清,并加入150 μl DMSO溶解紫色沉淀,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570 nm/630 nm,測(cè)定光密度D(λ)值。抑制率(%)=〔1-D(λ)實(shí)驗(yàn)孔/ D(λ)對(duì)照孔〕× 100。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)和30%抑制濃度(IC30)。

2 結(jié) 果

2.1雷公藤紅素及其配伍槲皮素抑制A549、Eca9706細(xì)胞增殖 雷公藤紅素濃度1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L時(shí)對(duì)人肺癌A549及濃度2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L時(shí)對(duì)人食管癌Eca9706細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用(P<0.05,P<0.01),且呈劑量依賴性。配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素在0.25、1.25 μmol/L使人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.01),而在其他更高濃度時(shí),配伍槲皮素后抑制率均無顯著差異(P>0.05);配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素在0.25、1.25及2.50 μmol/L時(shí),人食管癌Eca9706細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.01,P<0.05),而在其他更高濃度時(shí),配伍槲皮素后抑制率均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 雷公藤紅素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、食管癌Eca9706細(xì)胞增殖抑制率的量效關(guān)系及配伍槲皮素前后兩種癌細(xì)胞增殖抑制率的比較

2.2雷公藤紅素配伍槲皮素前后細(xì)胞的IC30、IC50值 雷公藤紅素對(duì)A549、Eca9706細(xì)胞的IC50為4.687、4.939 μmol/L,IC30為1.774、1.989 μmol/L;配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素對(duì)A549、Eca9706細(xì)胞的IC50分別降低至2.064、2.040 μmol/L,IC30分別降低至0.337、0.408 μmol/L。表明配伍槲皮素對(duì)雷公藤紅素的抗癌藥效起到了協(xié)同增效作用。

3 討 論

以雷公藤紅素為重要活性成分的中藥(如昆明山海棠、雷公藤)和以槲皮素為重要活性成分的中藥(如枸杞子、菟絲子、淫羊藿、金錢草)配伍,?？山M方昆仙膠囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子、淫羊藿組成)、復(fù)方雷公藤湯〔16〕(含雷公藤與金錢草)應(yīng)用。本文之前的研究已經(jīng)從飲片配伍層面證實(shí)雷公藤與金錢草配伍對(duì)人肺癌A549和食管癌Eca9706細(xì)胞增殖具有抗癌增效作用〔17,18〕。MTT法是體外生物活性評(píng)價(jià)最常用的研究方法之一,已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤等多種生物活性的研究和評(píng)價(jià),尤其適合于對(duì)單體成分活性的評(píng)價(jià)〔18～21〕。本研究結(jié)果表明,配伍槲皮素對(duì)雷公藤紅素對(duì)人肺癌A549及食管癌Eca9706細(xì)胞具有明顯的抗癌協(xié)同增效作用且雷公藤紅素的抗癌增效作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。進(jìn)一步從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面考察雷公藤紅素配伍槲皮素的抗癌增效作用及其機(jī)制,將是后續(xù)研究的重要方向。