黃金 王欣雨 高玲莉 馮曉東,2

(1河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450000;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

腦卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中對(duì)人類(lèi)健康嚴(yán)重威脅的疾病之一,具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高等特點(diǎn)〔1〕。認(rèn)知障礙是腦卒中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響了腦卒中患者的生活質(zhì)量。經(jīng)過(guò)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)約64%的腦卒中后遺癥患者存在認(rèn)知功能障礙〔2〕,約24%的腦卒中患者可能會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙〔3〕。認(rèn)知功能是高等動(dòng)物腦功能在定向力、計(jì)算力、記憶力和學(xué)習(xí)能力等方面的綜合性表達(dá),腦卒中后認(rèn)知功能障礙(PSCI)在臨床常表現(xiàn)為患者具有不同程度和類(lèi)型的計(jì)算、學(xué)習(xí)記憶能力等障礙,其歸屬于血管性認(rèn)知功能障礙范疇。認(rèn)知功能障礙在腦缺血再灌注大鼠群體中主要體現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶功能的障礙。近年來(lái)有關(guān)自噬在腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制中的研究成果顯著,有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)器官發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí),機(jī)體會(huì)上調(diào)自噬水平,從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。 因此,本研究擬通過(guò)觀察電針神庭、百會(huì)穴后腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)自噬體及溶酶體的形成及自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3抗體(LC3)Ⅱ和酵母Atg6基因在哺乳動(dòng)物中的同源類(lèi)似物(Beclin)-1的水平〔4〕來(lái)拓展自噬在腦缺血再灌注損傷中的研究。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只清潔級(jí)健康成年SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(260±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011,于2018年7月20日至8月2日由河南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)單位許可證編號(hào):SYXK(豫)2015-0005。喂養(yǎng)條件為無(wú)菌環(huán)境,室溫恒定、控制為25 ℃,SD大鼠自由進(jìn)食和飲水。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行取材。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司);Mini PROTEAN 型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀Powerpac Universal型電泳系統(tǒng)、YCYCLER 型梯度PCR 儀(美國(guó)BIO-RAD 公司);高速離心機(jī)LUMACCP100WX(江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);全自動(dòng)超薄切片機(jī)LEICA EM UC(孚光精儀有限公司);組織處理機(jī)EM TP(徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司);日本透射電子顯微鏡JEM-1400(上海鑄金分析儀器有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 Gluta固定液(電鏡專(zhuān)用,2.5%)(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):P1126);鋨酸、環(huán)氧樹(shù)脂(Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司,批號(hào):419494、45347);兔IgG抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗、LC3Ⅱ(美國(guó)GeneTex公司,批號(hào):CTX213110-0、GTX127375);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、10×TBST緩沖液、彩虹245廣譜Marker 2×250 μl、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒 500孔 solarbio、高效cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄、SYBR GREEN Master Mix熒光定量PCR試劑盒、PAGE預(yù)制膠、超純RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):P1200-50、T1070-500、D1060-500、T1081-500 ml、PR1930-100、PC0020-500、R211-01、Q111-02、G00002、SN-0301)。

1.4動(dòng)物分組和模型制備 將45只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為電針組、模型組和假手術(shù)組各15只。對(duì)直徑為0.24 mm的線栓頭部進(jìn)行加熱,制成光滑圓鈍的圓頭狀,在距離頭端18～20 mm處作一標(biāo)記,隨后放置在避光的肝素中備用。造模前所有大鼠禁食12 h,自由飲水。大鼠稱(chēng)重后,用10%水合氯醛以3 ml/kg劑量行腹腔注射進(jìn)行麻醉。將大鼠以仰臥位固定于鼠板,備皮,碘伏消毒,于頸部正中線作一縱向切口,鈍性分離皮下組織和腺體,暴露并分離出頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),注意保護(hù)CCA旁的迷走神經(jīng)。用羊腸線分別結(jié)扎CCA和ECA近心端,用動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端。用顯微剪刀在CCA近分叉處作一小切口,將制備好的線栓經(jīng)切口處插入,經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入ICA,進(jìn)入18～20 mm處稍感阻力時(shí)停止插栓。此時(shí)用提前備好在ICA近心端的羊腸線結(jié)扎ICA近心端,以防出血。頸部傷口用4-0縫合線行常規(guī)縫合。2 h后行再灌注,將線栓輕柔回抽至CCA分叉處。術(shù)中和術(shù)后將室溫控制在25 ℃左右。術(shù)后造模大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅切開(kāi)頸部皮膚,暴露并游離出CCA、ECA和ICA,然后消毒切口,并用4-0縫合線進(jìn)行縫合。造模后腹腔注射慶大霉素2 U/只,連續(xù)注射3 d,以預(yù)防術(shù)后感染。按照0.1 mg/kg劑量注射呋塞米,防止術(shù)后出現(xiàn)腦水腫。

1.5干預(yù)措施 電針組造模后回籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔5〕中的定位的方法去選取“神庭”及“百會(huì)”穴,應(yīng)用GM101電針儀,電壓峰值6 V,以針體輕輕抖動(dòng)為度,疏密波,頻率1～20 Hz,每次30 min,每日1次,術(shù)后2 h開(kāi)始進(jìn)行,直至大鼠被處死。模型組造模成功后回籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。只給予同等條件抓取,不進(jìn)行電針治療。假手術(shù)組造模后回籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。只給予同等條件抓取,不給予任何治療。

1.6神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 采用Longa等〔6〕評(píng)分法在腦缺血再灌注損傷后2 h,對(duì)蘇醒大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)分,0分無(wú)神經(jīng)損傷癥狀,1分不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪,2分向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈,3分行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒,4分不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。0分和4分均認(rèn)為造模不成功。將1～3分造模成功的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。造模成功大鼠分別于造模后第3、7天進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。評(píng)分工作由對(duì)實(shí)驗(yàn)分組不知情的工作人員進(jìn)行。

1.7透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛行腹腔麻醉后,打開(kāi)胸腔并暴露心臟,剪開(kāi)右心耳,從左心室依次灌注0.9%生理鹽水,直至流出液變清澈,后用4 ℃多聚甲醛500 ml進(jìn)行固定,待大鼠四肢逐漸出現(xiàn)抽搐或者四肢僵硬時(shí),說(shuō)明灌注成功。于冰塊上斷頭取腦,迅速剝離腦組織,找到皮質(zhì)部,并將皮質(zhì)部組織切成1 mm3大小的正方體(取材要求快、準(zhǔn)、穩(wěn)),迅速用牙簽將樣品移至盛有2.5%戊二醛溶液的1.5 ml離心管中,固定4 h。后將樣品用0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗4次,每次10 min。1%鋨酸固定2 h吸出固定液后,再用0.1 mol/L pH7.0的PBS漂洗4次,每次10 min。用梯度濃度(50%、70%、80%、95%)乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理,每個(gè)濃度處理10 min,再用100%乙醇溶液處理20 min,最后用100%丙酮處理20 min。用環(huán)氧樹(shù)脂812進(jìn)行包埋并在常溫條件下過(guò)夜。 后用牙簽取出經(jīng)滲透處理的樣品至預(yù)先盛有300 μl包埋劑的0.5 ml干燥離心管中,分別于37 ℃和45 ℃條件下各聚合12 h,再于60 ℃條件下聚合24 h。后用徠卡EM UC 7超薄切片儀進(jìn)行修塊、切片,再用飽和醋酸雙氧釉水溶液染色20 min。雙蒸水沖洗、烘干后再用檸檬酸鉛溶液染色10 min。再用雙蒸水沖洗和烘干,最后用日本透射電子顯微鏡JEM-1400拍照觀察。

1.8Western印跡檢測(cè)大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后,用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注后于冰上斷頭取腦,迅速剝離腦組織并分離出皮質(zhì)區(qū),后放入盛有液氮的容器中,然后轉(zhuǎn)存至-80 ℃冰箱以備用。①組織蛋白的提取:取大鼠腦組織200 mg,加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解緩沖液2 ml,于1 500 r/min、4 ℃條件下離心5 min,吸取上清液置于離心管中,后取少量上清液用于BCA法測(cè)蛋白濃度,其余上清液按每100 μl加入33.3 μl 4×上樣緩沖液混勻,于沸水浴中放置10 min,分裝后-80 ℃存放。②制備SDS-PAGE:將電泳所需的試劑和儀器恢復(fù)至室溫;并清洗和干燥電泳所需的玻璃板,后將其進(jìn)行固定;配制10 ml 12%分離膠〔ddH2O 3.3 ml、30%丙烯酰妥(4 ℃避光)4.0 ml、1.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.8)2.5 ml、10%SDS 0.06 ml、10%過(guò)硫酸銨(后加) 0.12 ml、四甲基乙二胺(后加)0.006 ml〕和4 ml 5%濃縮膠〔ddH2O 2.8 ml、30%丙烯酰胺(4 ℃避光) 0.66 ml、0.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH6.8) 0.50 ml、10%SDS 0.06 ml、10%過(guò)硫酸銨(后加) 0.06 ml、四甲基乙二胺(后加) 0.005 ml〕;倒掉去離子水覆蓋液,并用吸水紙把殘留液體吸去,垂直放置凝膠板,加入5%濃縮膠,插入樣品梳,室溫下凝膠約40 min,后拔去梳子將玻璃板凹面緊貼電泳槽,兩側(cè)用夾子固定;③樣品變形及電泳:從-80 ℃冰箱取出適量的樣本組織,插入冰中待其融化,根據(jù)蛋白定量結(jié)果,加入相應(yīng)體積的5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液,輕輕混勻后,在95 ℃下變性10 min,后立即插入冰中待用,后將蛋白樣品加入凝膠孔中,電泳儀設(shè)置為穩(wěn)壓狀態(tài),接通電源,將蛋白樣品加入混有電泳液的電泳槽中,垂直緩慢加入,添加適量的電泳液后,蓋上電泳蓋子;打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)進(jìn)行電泳。④凝膠轉(zhuǎn)膜及檢測(cè):上述操作結(jié)束后,把電泳得到的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,繼而分別通過(guò)一抗和二抗進(jìn)行孵育檢測(cè);遵循膠在負(fù)極,膜在正極的原則(60 V,130 mA,1 h)按照濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)印。⑤封閉:將膜用PBS沖洗10 min后用5%脫脂奶粉搖動(dòng)封閉1 h;⑥一抗反應(yīng):將一抗按照1∶10 000稀釋后,于封閉液中將膜取出,濾紙吸去殘留液,將膜于雜交袋中4 ℃孵育過(guò)夜;⑦洗膜:用1×TBST在室溫下?lián)u床上洗3次,時(shí)間分別為10 min×3次;⑧二抗反應(yīng):將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液(1∶10 000)中,室溫、避光下緩慢搖動(dòng)60 min;⑨洗膜:步驟同⑦,洗去游離的二抗;⑩曝光洗片,用ImageJ軟件分析其灰度值。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ和Beclin-1 mRNA水平 樣本處理:SD大鼠常規(guī)麻醉后,于冰上迅速取出大腦并剝離出海馬組織,將其放入盛有適量液氮的容器內(nèi),再轉(zhuǎn)存至-80 ℃的冰箱內(nèi)備用。取20～50 mg的海馬組織放入1.5 ml EP管內(nèi),在其中加入1 ml Trizol迅速研磨,震蕩30 s,后再向EP管內(nèi)加入三氯甲烷40 μl,在振蕩器上振蕩15 s以實(shí)現(xiàn)充分混勻,將離心機(jī)調(diào)至4 ℃、12 000 r/min的參數(shù)下離心3 min,后用移液槍吸取上清液200 μl放入新的EP管內(nèi),加入等量預(yù)冷的無(wú)水乙醇,再在振蕩器上充分混勻,在25 ℃條件下將離心管靜置10 min,繼續(xù)在4 ℃、12 000 r/min參數(shù)設(shè)定的離心機(jī)內(nèi)離心10 min,丟棄濾液后,可見(jiàn)離心管底部有少量沉淀物質(zhì)析出,后在離心管內(nèi)加入600 μl的洗滌緩沖液溶液,在上述離心機(jī)的參數(shù)條件下繼續(xù)離心1 min,棄濾液,再用600 μl的洗滌緩沖液溶液在同等條件下進(jìn)行離心,棄濾液,為了徹底去除廢液,需把核酸純化柱空管放在12 000 r/min的離心機(jī)內(nèi)離心1 min,取出核酸純化柱空管,將其放入1.5 ml新的無(wú)RNA酶的EP管內(nèi),后向EP管內(nèi)加入無(wú)核糖核酸水50 μl,25 ℃下靜止1～2 min后,在4 ℃、12 000 r/min條件下繼續(xù)離心1 min,收集濾液獲取總的RNA量。配制第一鏈cDNA合成反應(yīng)液,反應(yīng)體系為20 μl,取計(jì)算得到的 RNA樣本于EP管內(nèi),后向管內(nèi)加入相對(duì)應(yīng)的無(wú)核糖核酸水,將溶液補(bǔ)足到12 μl。按照以下條件完成第一鏈cDNA的合成反應(yīng):25 ℃,5 min;50 ℃,15 min;85 ℃,5 min。qPCR體系配制實(shí)驗(yàn)所需的液體〔AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μl、引物1(10 μmol/L)0.4 μl、引物2(10 μmol/L)0.4 μl、參比染料10.4 μl、模板DNA 2.0 μl、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20.0 μl〕,將所有液體加入EP管內(nèi)后放在振蕩器上充分混勻后置于離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心,最后放置于PCR儀上。PCR擴(kuò)增體系總量為20 μl,其中cDNA模板 2.0 μl,正向引物0.4 μl,反向引物0.4 μl,反應(yīng)混合物10 μl,無(wú)菌蒸餾水6.8 μl。設(shè)定擴(kuò)增程序:預(yù)變性:95 ℃,5 min;95 ℃,10 s。循環(huán)反應(yīng)參數(shù):退火/延伸溫度60 ℃,30 s;95 ℃,15 s,共40個(gè)循環(huán)。融解曲線參數(shù):100 ℃,60 s;95 ℃,15 s。記錄每個(gè)管內(nèi)腦組織樣本所產(chǎn)生的Ct值,計(jì)算出每個(gè)樣本相應(yīng)的Ct值,得出每個(gè)蛋白相應(yīng)的mRNA量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 假手術(shù)組模型制備后,無(wú)神經(jīng)功缺損癥狀,神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分為0分;電針組腦缺血再灌注損傷后經(jīng)電針神庭和百會(huì)穴后,于第7天神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組造模前后均無(wú)死亡,電針組在造模后死亡1只,模型組造模后死亡3只。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較(n)

2.2透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 電針組病灶周?chē)纳窠?jīng)細(xì)胞內(nèi)有大量溶酶體及自噬體或二者的結(jié)合物形成,線粒體腫脹或呈球形,且線粒體嵴的結(jié)構(gòu)排列錯(cuò)亂甚至消失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布散亂無(wú)規(guī)則,且多呈囊性變,其周?chē)嬖诖罅坑坞x核糖體。高爾基體腫脹、結(jié)構(gòu)排列紊亂,且其弓形結(jié)構(gòu)大部或者完全消失。同時(shí),皮質(zhì)區(qū)可觀察到含有大量吞噬物的膜性結(jié)構(gòu)(即自噬體)存在。與模型組相比較,電針組皮質(zhì)區(qū)自噬體及溶酶體數(shù)量明顯增加;模型組大腦皮質(zhì)區(qū)溶酶體數(shù)量高于假手術(shù)組。見(jiàn)圖1。

紅色圓圈內(nèi)的結(jié)構(gòu)為自噬體或者自噬體與溶酶體的結(jié)合物圖1 3組皮質(zhì)區(qū)顯微結(jié)構(gòu)比較(×30 000)

2.3各組皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá) 與模型組相比,電針組腦缺血再灌注后損傷后皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.05);模型組腦缺血再灌注后損傷后皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白和mRNA水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 3組皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白水平

表2 各組LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)水平

3 討 論

腦卒中在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬“中風(fēng)”范疇,身居“風(fēng)、癆、臌、膈”四大疑難雜癥之首。中醫(yī)古籍對(duì)腦卒中后認(rèn)知障礙并無(wú)明確記載,但是,認(rèn)知障礙在中醫(yī)學(xué)古代文獻(xiàn)中多散見(jiàn)于“健忘”“善忘”“呆病”“遺忘”等證中〔7〕。腦卒中后認(rèn)知障礙基本病機(jī)以腎虛為本,血瘀痰濁為標(biāo),病位在腦。治療應(yīng)以活血化瘀,開(kāi)竅醒神,補(bǔ)腎為先,精氣為重。

電針治療是一種將毫針刺激與電生理效應(yīng)結(jié)合的治療方法,與普通針刺相比,行針時(shí)間長(zhǎng),刺激量強(qiáng),針感持久,方便靈活調(diào)整刺激量。本研究所選取的“神庭”“百會(huì)”二穴均歸屬督脈。督脈是奇經(jīng)八脈之一,陽(yáng)脈及全身經(jīng)脈之海。神庭穴:作為督脈、足太陽(yáng)、陽(yáng)明之會(huì),定位在頭部,發(fā)際直上1.667 cm(0.5寸)處,具有凝神醒腦、平喘降逆的作用;百會(huì)穴:頭部發(fā)際線正中直上16.667 cm(5.0寸),或頭頂正中與兩耳尖連線的交點(diǎn)處,為督脈、足太陽(yáng)之會(huì),能夠平衡人體陰陽(yáng)。神庭穴,又名天庭穴,古人云“神者,智之淵也”,認(rèn)為神庭“神處其中則靈,靈則應(yīng),應(yīng)則保身?！碧貏e在治療神志方面的疾病,神庭穴療效尤佳。百會(huì)穴,別名三陽(yáng)五會(huì),位于人體頭部正中,與大腦功能關(guān)系密切;百脈之會(huì),貫達(dá)全身;頭為諸陽(yáng)之會(huì),百脈之宗,而百會(huì)穴則為各經(jīng)脈之氣會(huì)聚之處;穴性屬陽(yáng),又于陽(yáng)中寓陰,故能通達(dá)陰陽(yáng)脈絡(luò)。針刺百會(huì)可增強(qiáng)記憶功能,醒腦開(kāi)竅;針刺神庭具有寧神、開(kāi)竅之用。本課題組通過(guò)前期大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究〔8～12〕及臨床觀察〔13,14〕發(fā)現(xiàn)電針神庭、百會(huì)二穴對(duì)PSCI的改善情況密切相關(guān)。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴(lài)性的降解途徑,以應(yīng)激和損傷時(shí)更為顯著;也是機(jī)體清除過(guò)量、老化蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器的重要途徑。適度的自噬是細(xì)胞完成自身代謝和細(xì)胞器更新的重要方式,對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及調(diào)控細(xì)胞損傷和老化具有重要意義〔15〕。Beclin-1是自噬基因,作為自噬的執(zhí)行者,Beclin-1蛋白除了接受自噬信號(hào),還可接受其他信號(hào)對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié),用Beclin-1作為自噬標(biāo)記物,也是檢測(cè)自噬的常用指標(biāo)〔16〕。LC3Ⅱ含量反映細(xì)胞內(nèi)自噬水平〔17〕。透射電鏡下自噬全過(guò)程尤其是雙層膜結(jié)構(gòu),是檢測(cè)自噬體的金指標(biāo)〔18〕。Lu等〔19〕通過(guò)建立腦缺血再灌注模型后通過(guò)Western印跡法研究發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3表達(dá)均顯著升高,從而證明了在大腦皮質(zhì)損傷的過(guò)程中自噬所發(fā)揮的重要作用。孔瑩等〔20〕發(fā)現(xiàn),針刺百會(huì)穴可以提高AD大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ的表達(dá),從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果說(shuō)明,大鼠經(jīng)過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)后體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種自我保護(hù)性機(jī)制,進(jìn)而達(dá)到機(jī)體自我保護(hù)與修復(fù)的作用,電針神庭、百會(huì)穴對(duì)機(jī)體在氧化應(yīng)激刺激后能產(chǎn)生一種較機(jī)體本身更高的保護(hù)性機(jī)制,從而達(dá)到腦保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)作用。電針治療后,大鼠皮質(zhì)區(qū)溶酶體增多,能夠清除一些對(duì)機(jī)體有害的物質(zhì)進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上,自噬在腦缺血損傷后所發(fā)揮的保護(hù)性作用,適度的自噬對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)性機(jī)制,但過(guò)度自噬卻對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步的損害。那么如何控制把握自噬的程度仍是目前基礎(chǔ)研究中亟待解決的問(wèn)題。