孫傳偉 蔣曼妃 吳煌福 王璐瑤 譚光宏

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1乳甲外科,海南 ?？?570100;2全科醫(yī)學(xué)科)

乳腺癌是最致命和最普遍的癌癥之一,2020年全球新增226萬(wàn)例乳腺癌患者,占所有女性癌癥新增病例的1/4,嚴(yán)重威脅著廣大女性健康,其中人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)-2陽(yáng)性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～30%,惡性程度較其他分型乳腺癌高,預(yù)后較差〔1〕。目前臨床上多采用手術(shù)切除并輔以放化療的方式治療乳腺癌,但治療后腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移使得乳腺癌的遠(yuǎn)期生存率仍然不容樂(lè)觀,因此探究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并找到有效的治療靶點(diǎn)意義重大。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)〔2〕,長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)和微小核糖核酸(miRNA)表達(dá)譜的異常與各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。LncRNA FoxP4-AS1已被證實(shí)在胰腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和鼻咽癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)且能夠影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能〔3～5〕。有多個(gè)報(bào)道指出〔6,7〕,miR-136-5p在宮頸癌、甲狀腺癌等多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤功能。遷移侵襲增強(qiáng)因子(MIEN)1在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中大量表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移,有文獻(xiàn)報(bào)道〔8〕,miR-136-5p與MIEN1存在著靶向作用關(guān)系。有研究顯示〔9〕FoxP4-AS1在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)水平,且能夠通過(guò)靶向調(diào)控miR-136-5p表達(dá),提高宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,然而其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用仍不清楚。本研究選取HER-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探究FoxP4-AS1靶向miR-136-5p對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3(生產(chǎn)批號(hào)BFN60700185,購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。

1.2藥物與試劑 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(購(gòu)自美國(guó)GENMED公司,生產(chǎn)批號(hào)GMS10026);si-FoxP4-AS1(正義5′-CCAUCGUAUGCAAUUGA-3′,反義5′-CGUUAACGUAUAGA-3′)、pcDNA-FoxP4-AS1(正義5′-CGUAAGAUGAUAGAUA-3′,反義5′-GUAAGUA-GCAGCUAACGU-3′)、FoxP4-AS1-NC(正義5′-CC-GAUAAUGUAGCUCU-3′,反義5′-AGUAGUAGAUGCAUAAU-3′)、miR-136-5p mimic(正義5′-AGUA-UAGUCCUACC-3′,反義5′-GUGUAAUGAUCCCUAA-3′)、miR-136-5p inhibitor(正義5′-GUGAAUCAUUC CUAC-3′,反義5′-CUAAAUUAGAUAUACGG-3′)、miR-NC(正義5′-UGAAUGCUAUCAUUG-3′,反義5′-AAUGCUAUAUCAAC-3′)、野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體(Luc-3′UTR-WT/MUT)及引物(由上海賽百盛公司合成);結(jié)晶紫染液(購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?生產(chǎn)批號(hào)KL805211);;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)D0010,購(gòu)自北京索萊寶)兔抗人MIEN1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆及羊抗兔多克隆抗體(生產(chǎn)批號(hào)PA1-1110、PA1-830、PA5-11393、PA3-031A、PA5-27188、PA5-27192、PA5-11722、PA5-20126,購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)器材 BC 190型CO2培養(yǎng)箱,瑞士SALVIS;alpha 300S型光學(xué)顯微鏡,自德國(guó)WITec;Revolve Generation 2型熒光顯微鏡(購(gòu)自美國(guó)ECHO公司);3422型Transwell小室(購(gòu)自美國(guó)Owens Corning公司);S1000TMDual 48 Well型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司);Biosens 850型凝膠成像系統(tǒng),上海山富科學(xué)儀器有限公司;EPS-300型電泳儀,韓國(guó)Lab Companion。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 SKBR-3細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清(FBS),培養(yǎng)箱條件37 ℃、5%CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKBR-3細(xì)胞,細(xì)胞懸液于96孔板(5.0×105個(gè)細(xì)胞/孔)中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2 h。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-FoxP4-AS1(FoxP4-AS1下調(diào)組)、pcDNA-FoxP4-AS1(FoxP4-AS1上調(diào)組)、FoxP4-AS1-NC(FoxP4-AS1對(duì)照組)、miR-136-5p inhibitor(miR-136-5p下調(diào)組)、miR-136-5p mimic(miR-136-5p上調(diào)組)、miR-NC(miR對(duì)照組),根據(jù)制造商的說(shuō)明采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染。另以未轉(zhuǎn)染的SKBR-3細(xì)胞為空白組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。48 h后,在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下拍照計(jì)數(shù),測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。

1.5Transwell測(cè)定侵襲、遷移能力 分別取各組人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3用胰蛋白酶消化,磷酸鹽緩沖液沖洗,使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml。在Transwell小室上室(預(yù)先用基質(zhì)膠覆蓋)中加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加500 μl 10%血清培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室中未遷移細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,用4%多聚甲醛固定30 min,棄固定液后加入結(jié)晶紫染液染色10 min,用自來(lái)水沖洗膜,干燥,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)細(xì)胞。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn),無(wú)需在Transwell上室膜孔用基質(zhì)膠提前覆蓋,其余步驟同上。

1.6實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)測(cè)定FoxP4-AS1、miR-136-5p表達(dá)及MIEN1、E-Cadherin、MMP-9信使核糖核酸(mRNA)表達(dá) 分別取各組人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3,RT-qPCR檢測(cè)各目的基因mRNA的表達(dá)。FoxP4-AS1上游引物5′-CGTTAGACAGCAGCA-3′,下游5′-TGTAACGGATACGC-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp;miR-136-5p上游引物5′-TGACGATGAGTAACG-3′,下游5′-GTCAATGTAGATGTAC-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度184 bp;MIEN1上游引物5′-TTACGTAGTAGCCAC-3′,下游5′-GACCGTAGTACGTAAC-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度155 bp;E-cadherin上游引物5′-TAAGTCGTAGTATCCAGTC-3′,下游5′-CTGAATGCCTGTAAG C-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度214 bp;MMP-9上游引物5′-AGTGTAGTACGTACGTATG-3′,下游5′-AGTCCTAGTATGCCTAAC-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度259 bp;U6上游引物5′-TTAACGTAGAGCTCTGACC-3′,下游5′-CGAGATGC TTAACCGT-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度104 bp;β-actin上游引物5′-TGCCTAGTAGCTCGTAGA-3′,下游5′-CCGTAGTAGCTCGTAAG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度301 bp。除miR-136-5p(U6為內(nèi)參)的其余基因以β-actin為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因表達(dá)。

1.7Western印跡測(cè)定MIEN1、E-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá) 分別取各組人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3,使用細(xì)胞裂解液從各組細(xì)胞提取總蛋白,Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂牛奶阻斷膜1 h,與一抗(1∶2 000)抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。次日,與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h,顯色反應(yīng),Biosens 850型凝膠成像系統(tǒng)分析處理。以β-actin為內(nèi)參,通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證FoxP4-AS1與miR-136-5p的靶向關(guān)系 TargetScan miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件(https://www.targetscan.org/vert_80/)用來(lái)預(yù)測(cè)FoxP4-AS1與miR-136-5p的結(jié)合位點(diǎn)。使用PCR擴(kuò)增miR-136-5p與FoxP4-AS1的結(jié)合片段。隨后,將擴(kuò)增產(chǎn)物插入Luc-3′UTR-WT載體,構(gòu)建野生型報(bào)告基因(野生型FoxP4-AS1)。對(duì)結(jié)合片段進(jìn)行定點(diǎn)誘變以構(gòu)建一個(gè)FoxP4-AS1突變體報(bào)告基因(突變型FoxP4-AS1)。接下來(lái),用重組報(bào)告質(zhì)粒和miR-136-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染SKBR-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h,收集細(xì)胞,使用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。以螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值代表熒光素酶相對(duì)活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 FoxP4-AS1對(duì)照組、FoxP4-AS1下調(diào)和上調(diào)組、miR對(duì)照組、miR-136-5p下調(diào)和上調(diào)組轉(zhuǎn)染效率分別為(90.41±3.15)%、(85.92±1.83)%、(87.70±2.26)%、(85.44±1.61)%、(91.26±2.27)%、(88.52±1.42)%,見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(×100)

2.2各組細(xì)胞FoxP4-AS1、miR-136-5p表達(dá)、MIEN1、E-cadherin、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá) 與空白組和FoxP4-AS1對(duì)照組比較,FoxP4-AS1下調(diào)組miR-136-5p表達(dá)、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高,FoxP4-AS1表達(dá)、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);FoxP4-AS1上調(diào)組miR-136-5p表達(dá)、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低,FoxP4-AS1表達(dá)、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),與空白組和miR對(duì)照組比,miR-136-5p下調(diào)組miR-136-5p表達(dá)、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)降低,FoxP4-AS1表達(dá)、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)升高;miR-136-5p上調(diào)組miR-136-5p、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加,FoxP4-AS1表達(dá)、MIEN1、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.05),見(jiàn)圖2、表1。

表1 各組細(xì)胞FoxP4-AS1、miR-136-5p表達(dá)及MIEN1、E-cadherin、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)

1～7:空白組、FoxP4-AS1對(duì)照組、FoxP4-AS1下調(diào)組、FoxP4-AS1上調(diào)組、miR對(duì)照組、miR-136-5p下調(diào)組、miR-136-5p上調(diào)組圖2 各組細(xì)胞MIEN1、E-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)

2.3各組細(xì)胞侵襲、遷移能力 與空白組和FoxP4-AS1對(duì)照組比較,FoxP4-AS1下調(diào)組的侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)目明顯下降,FoxP4-AS1上調(diào)組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P<0.05)。與空白組和miR對(duì)照組比較,miR-136-5p下調(diào)組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯升高,miR-136-5p上調(diào)組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖3、表2。

表2 FoxP4-AS1及miR-136-5p表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的影響個(gè),n=6)

圖3 各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4FoxP4-AS1靶向調(diào)控miR-136-5p驗(yàn)證 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)提示miR-136-5p和FoxP4-AS1之間存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)因,見(jiàn)圖4。miR-136-5p mimic組轉(zhuǎn)染野生型FoxP4-AS1細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性明顯低于miR-NC組(P<0.05);miR-136-5p mimic組轉(zhuǎn)染突變型FoxP4-AS1細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性與miR-NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 熒光素酶相對(duì)活性比較

圖4 FoxP4-AS1與miR-136-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)

3 討 論

乳腺癌的發(fā)病是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果,其中包括年齡、月經(jīng)及生育情況、性激素水平、壓力、肥胖、抽煙酗酒等多種因素〔10〕。目前臨床上多采用手術(shù)、放療、化療及內(nèi)分泌治療等方法治療乳腺癌,但存在不良反應(yīng)較大、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問(wèn)題〔11〕。近年來(lái),分子靶向藥物的出現(xiàn)為治療HER-2陽(yáng)性乳腺癌提供了新的方向,因此有關(guān)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究亦成為近幾年的研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果提示,FoxP4-AS1在乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移中起促進(jìn)作用,miR-136-5p在乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移中起抑制作用。有研究顯示〔12〕,FoxP4-AS1在胃癌中高表達(dá),敲低FoxP4-AS1表達(dá)可阻礙胃癌細(xì)胞增殖,抑制其侵襲、遷移和血管生成。另有報(bào)道指出〔13〕,LncRNA FAM83H-AS1通過(guò)抑制miR-136-5p的表達(dá)促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖,與上述研究相一致。

本研究提示,FoxP4-AS1可提高M(jìn)IEN1、MMP-9的表達(dá),降低miR-136-5p、E-cadherin表達(dá),而miR-136-5p可下調(diào)MIEN1、MMP-9表達(dá),上調(diào)E-cadherin表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了FoxP4-AS1可直接靶向調(diào)控miR-136-5p,因此合理推測(cè)FoxP4-AS1可能是通過(guò)靶向抑制miR-136-5p來(lái)促進(jìn)MIEN1、MMP-9的表達(dá),抑制E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增加乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的作用的。FOXP4-AS1可通過(guò)推進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變,促進(jìn)細(xì)胞增殖〔14〕。Li等〔15〕發(fā)現(xiàn),FOXP4-AS1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中呈顯著高表達(dá),且表達(dá)量與患者預(yù)后較差有密切關(guān)系。MIEN1是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種促癌基因,在多種惡性腫瘤中通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移〔16〕。E-cadherin是EMT的重要標(biāo)志之一,E-cadherin下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性降低,細(xì)胞由上皮樣轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣〔17〕。MMP-9主要通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)抑制腫瘤細(xì)胞間的黏附性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移〔18〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔19〕,FoxP4-AS1能夠通過(guò)靶向調(diào)控miR-136-5p的表達(dá),促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,加快癌癥進(jìn)展,本研究結(jié)果與該研究相一致。