鄭通 肖志遠 汪麗丹

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

甲狀腺癌(TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率逐年上升〔1〕。其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占90%以上〔2〕。細胞衰老在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)中起至關重要的作用〔3〕。本研究從腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載TC數(shù)據(jù),在特定的篩選條件下篩選出細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKN)2B基因,并對其表達進行分析,從而為篩選與PTC進展相關的基因提供理論依據(jù)。CDKN2B與CDK4-細胞周期蛋白D復合體相互作用,抑制Rb的磷酸化,從而阻止細胞周期的進展〔4,5〕。在干細胞或祖細胞的細胞衰老過程中發(fā)揮重要作用,促進機體衰老。同時,參與調(diào)控細胞周期,參與細胞增殖和腫瘤的進展〔6〕。腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)已成為一種臨床相關且高度可重復的生物標志物,能夠影響TC預后和對治療的反應。腫瘤細胞與其微環(huán)境功能結(jié)合為一個整體,也稱為腫瘤微環(huán)境(TME)。TME主要由腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)細胞、微血管、各種細胞因子和趨化因子組成。TME中的所有成分在腫瘤發(fā)生和進展中起重要作用。其中,免疫細胞是可能影響TC臨床結(jié)果的最關鍵集群〔7〕。本文擬分析細胞衰老基因(AGs)CDKN2B上調(diào)與TC侵襲性及免疫細胞浸潤的關系。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載TC相關RNA序列表達數(shù)據(jù),得到并納入58個正常組織和510個腫瘤組織。從CellAge獲得與細胞衰老相關的278個人類基因。

1.2衰老相關基因的選擇 使用mRNA表達譜、limma軟件包和R軟件(V4.1.2)中的Wilcoxon秩和檢驗(|log2FC |>1,FDR<0.05)來顯示TC隊列中表達顯著不同的AGs。

1.3TCGA數(shù)據(jù)庫分析CDKN2B在不同腫瘤組織中的表達 TCGA數(shù)據(jù)庫下載33種癌癥表達譜,對比33種癌癥中CDKN2B mRNA的表達情況。

1.4CDKN2B上調(diào)在TC及癌旁組織的差異表達 檢測CDKN2B在TC中mRNA表達,分析TCGA和GSCA兩大數(shù)據(jù)庫中CDKN2B的表達數(shù)據(jù)。使用受試者工作特征(ROC)曲線區(qū)分CDKN2B在TC組織與正常組織的表達。

1.5CDKN2B mRNA表達與臨床數(shù)據(jù)的關系 使用Mexpress數(shù)據(jù)庫分析CDKN2B在13個表型中的關系。包括性別、初次病理診斷時的年齡、轉(zhuǎn)移部位、瘤體深度、瘤體長度、瘤體寬度、病理原發(fā)腫瘤(T)、病理區(qū)域淋巴結(jié)(N)、病理遠處轉(zhuǎn)移(M)、初次治療后新的腫瘤事件初次治療后的新腫瘤事件、組織學類型、個人終身風險輻射暴露指標、個人腫瘤癌癥狀態(tài)、腫瘤分期、樣本類型和拷貝數(shù)。

1.6生物信息學 使用R軟件中的pheatmap和ggpubr包來開發(fā)火山圖、熱圖和使用GOplot包對46個差異表達基因進行基因本體功能注釋(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集。

1.8臨床資料 收集錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2019年1月至2021年1月收治的老年PTC患者標本,包括癌及癌旁配對正常甲狀腺組織120例,其中男26例,女94例,年齡50～83歲。納入標準:①所有患者未進行放化療;②術后病理證實為PTC。排除標準:①特殊病理類型;②有TC家族遺傳史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.9主要試劑 一抗兔抗人CDKN2B(A01500-1,boster,中國)、辣根過氧化物酶(HRP)-標記山羊抗兔IgG(111-035-003,Jackson ImmunoResearch,美國)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(DAB-1031,邁新試劑,中國)。

1.10方法 免疫組化SABC法檢測CDKN2B蛋白表達。組織用10%甲醛溶液固定,脫水透明,蠟包埋,切成4 μm厚的連續(xù)切片,微波修復,3%過氧化氫孵育,血清封閉。一抗(4 ℃過夜)、依次加入二抗,DAB顯色、蘇木素重染、常規(guī)脫水、透明、中性黏接封口。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果采用雙盲評分法解釋。結(jié)果判定:采用蘇木素-伊紅染色法觀察免疫反應物質(zhì)標記的組織切片顏色變化。將其轉(zhuǎn)換為顏色地圖,并計算不同級別的值。陽性結(jié)果為棕黃色顆粒沉淀,按顏色強度評分:無顏色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。染色細胞百分比:所有細胞中陽性細胞百分比≤9%為0分;10%～25%為1分;26%～50%為2分;51%～74%為3分;≥75%為4分。著色強度乘以陽性細胞百分比>3時為陽性,結(jié)果分為0～2(-)、3～4(+)、6～8()和9～12()水平。

1.11統(tǒng)計學方法 采用R(V4.1.2)和SPSS25.0軟件進行Wilcoxon符號秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TC中AGs的表達 對278個AGs進行分析,結(jié)果顯示46個AGs都有表達差異。17個上調(diào)基因和29個下調(diào)基因,根據(jù)FDR<0.05和〔log2(FC)〕>1的標準進行鑒定(圖1)。散點圖顯示這些腫瘤組織與非腫瘤組織的差異表達基因。見圖2。

圖1 TC中46AGs表達差異

圖2 TC中AGs的表達

2.2CDKN2B在泛癌中的表達情況 與癌旁正常組織相比,33種癌癥中21種CDKN2B顯著上調(diào)。不同癌癥類型中CDKN2B mRNA異常表達,見圖3。

與癌旁正常組織相比:1)P<0.001,2)P<0.01,3)P<0.05;圖4同圖3 CDKN2B在泛癌中的表達

2.3TC患者中CDKN2B的mRNA表達 TCGA數(shù)據(jù)庫中配對數(shù)據(jù)分析顯示,TC組織(n=58)中CDKN2B mRNA的表達水平均明顯高于癌旁正常組織(n=58,P<0.001,圖4A)。非配對數(shù)據(jù)510例TC樣本和58例正常樣本中CDKN2B的mRNA表達水平差異顯著(P<0.001,圖4B);GSCA數(shù)據(jù)庫中配對數(shù)據(jù)分析顯示,TC組織(n=59)中CDKN2B mRNA的表達水平均明顯高于癌旁正常組織(n=59,P<0.001,圖4C)。

圖4 CDKN2B在TC中的mRNA和蛋白表達

2.4ROC曲線分析 CDKN2B的曲線下面積(AUC)值為0.961(95%CI=0.944～0.979)。在臨界值為1.945時,CDKN2B的敏感性、特異性和準確性分別為96.58%、84.53%和85.74%。陽性預測值為97.5%,陰性預測值為36.4%。見圖5。

圖5 CDKN2B對TC患者診斷價值ROC曲線

2.5CDKN2B mRNA表達與相關因素的關系 Mexpress數(shù)據(jù)庫分析在13個表型中,CDKN2B mR-NA的表達與組織學類型、病理M、病理N、個人腫瘤癌癥狀況、性別、腫瘤分期、總生存時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

根據(jù)美國甲狀腺協(xié)會（ATA）、美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡（NCCN）、歐洲腫瘤內(nèi)科學會（ESMO）等發(fā)布的甲狀腺疾病診治指南推薦，對甲狀腺結(jié)節(jié)的處理意見均以US-FANC檢查結(jié)果為依據(jù)［6］。我國相關指南也提出在術前評估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性時，US-FANC是敏感度和特異度最高的方法［7］。本研究所得病理結(jié)果的診斷敏感性98.5%、特異性85.7%，且卡方檢驗顯示術前US-FANC和術后病理比較無顯著差異。

圖6 615例TC患者CDKN2B基因表達與臨床資料的關系

2.6差異表達的AGs的功能富集 在GO term富集分析中這些基因明顯與生長因子受體信號通路和細胞衰老信號通路相關。KEGG通路富集分析主要與細胞衰老和P53信號通路相關。見圖7。

圖7 差異表達的AGs GO和KEGG分析

2.7TC組織中CDKN2B的表達與免疫細胞浸潤的相關性 CDKN2B的表達與中性粒細胞(r=0.526,P<0.001)、CD4+T細胞(r=0.507,P<0.001)、樹突細胞(r=0.437,P<0.001)、B細胞(r=0.356,P<0.001)、巨噬細胞呈正相關(r=0.335,P<0.001)。CDKN2B與Th1細胞、Th2細胞、中性粒細胞、未成熟樹突細胞、巨噬細胞相關。見圖8、圖9、圖10。

圖8 CDKN2B表達與免疫浸潤水平的相關性

圖9 CDKN2B表達與免疫浸潤水平的相關性

圖10 CDKN2B表達與免疫浸潤水平的相關性

2.8PTC組織及其癌旁組織中CDKN2B蛋白陽性表達比較 免疫組織化學結(jié)果顯示,CDKN2B主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜,顯微鏡下可見黃色或棕黃色顆粒,癌旁組織局灶呈弱表達或不表達。見圖11。PTC及癌旁組織中CDKN2B表達的陽性率(67.5%和30.00%)差異顯著(χ2=33.771,P<0.001)。

圖11 CDKN2B在PTC組織和癌旁正常組織表達(SABC法,×200)

2.9CDKN2B表達與PTC患者臨床資料相關性 本研究分析了120例PTC患者的臨床相關資料,在PTC組織與癌旁組織中,CDKN2B表達與腫瘤直徑≥1 cm、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 CDKN2B陽性表達與PTC患者臨床資料相關性(n,n=120)

3 討 論

衰老是一個具有細胞自主分泌和旁分泌效應復雜的生物過程,對微環(huán)境存在顯著影響〔10,11〕。研究表明,可以通過衰老相關分泌表型激發(fā)的先天免疫和適應性免疫反應消除衰老細胞〔12〕。衰老相關分泌表型在短期內(nèi)存在積極作用。然而,從長遠來看,在癌癥的免疫抑制背景下,這些功能也有可能會成為有害因素進而促進腫瘤發(fā)展〔3〕。隨著人們對TC的深入認識,相關治療手段也不斷精進,使得PTC治療效果明顯改善,但仍存在部分PTC患者疾病進展迅速,現(xiàn)有治療手段無法控制疾病進展。因此,深入研究PTC增殖相關的分子基礎及信號通路,不僅可以進一步闡明PTC的發(fā)病機制,為PTC診斷和預后預測提供分子生物標志物,而且可以為分子靶向治療提供深遠的意義〔13〕。本研究結(jié)果表明,CDKN2B可能作為一個潛在的診斷生物標志物來區(qū)分PTC組織和正常甲狀腺組織。CDKN2B編碼的蛋白是腫瘤相關蛋白,在細胞增殖、凋亡和衰老中發(fā)揮重要作用〔14〕,有研究表明,CDKN2B過表達與胃癌預后不良有關〔15〕。Arya等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),在甲狀旁腺腺瘤中,CDKN2B基因高度高甲基化,而在正常甲狀旁腺組織中沒有觀察到這些基因的異常甲基化,表明CDKN2B 的高度甲基化促進了散發(fā)甲狀旁腺腫瘤的發(fā)展。本研究結(jié)果表明,CDKN2B與細胞衰老和P53信號通路密切相關。轉(zhuǎn)錄因子P53作為中心樞紐,將各種應激信號轉(zhuǎn)化為不同的細胞結(jié)果,如DNA修復、細胞周期停滯或細胞死亡等〔17〕。突變的P53是癌癥治療的有吸引力的藥物靶點,因此,靶向消耗p53也是抑制腫瘤進展的有效策略〔18〕。

通過比較PTC組織和正常的甲狀腺組織,本文發(fā)現(xiàn)CDKN2B的表達與中性粒細胞、CD4+T細胞、樹突細胞、B細胞、巨噬細胞呈正相關關系。這些細胞類型中的大多數(shù)已在研究中報道過,且在TME中具有不同的作用,如免疫逃逸和腫瘤生長和侵襲的調(diào)節(jié)(T細胞和巨噬細胞)〔4,19〕。然而,很少有研究關注幼稚B細胞、記憶B細胞、TFH細胞和靜息細胞在PTC中的作用。這些細胞也參與腫瘤的發(fā)展。如TFH細胞的浸潤與乳腺癌和肺癌的存活密切相關〔20,21〕。有研究證實,CD8+T細胞和嗜中性粒細胞的浸潤分別表明OS更好和更差;CD8+T細胞在DTC中表達上調(diào),預后更好,而中性粒細胞在ATC中表達上調(diào),預后更差〔22〕。

本研究結(jié)果初步揭示,CDKN2B在PTC中的臨床意義,CDKN2B在PTC中高表達且與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。CDKN2B進一步被確定為區(qū)別PTC的腫瘤標志物,且證明與免疫浸潤密切相關。本文初步發(fā)現(xiàn)CDKN2B可能與P53信號通路等相關,詳細的調(diào)控還有待一系列功能分析進行深入驗證。本研究為TC治療提供了一種新的分子生物學標志物。然而,CDKN2B在TC發(fā)生和發(fā)展中的具體分子機制還有待于進一步研究。