劉建兵 李文龍 王偉 李莉 郝敏

(山西醫(yī)科大學(xué) 1第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,山西 太原 036000;2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室)

宮頸癌(CC)是全球影響婦女健康的第4大常見癌癥,更是發(fā)展中國家的第2大常見癌癥〔1,2〕。宮頸鱗癌(CSCC)是CC的主要類型。在認(rèn)識到人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發(fā)CC發(fā)生的主要因素后,通過HPV的篩查和疫苗開發(fā),CC的預(yù)防已經(jīng)取得了顯著成就,但是轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性CC患者的總體預(yù)后仍然很差〔3〕。MicroRNAs (miRNAs)是一段含有20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,能夠通過干擾靶基因mRNA的穩(wěn)定性及翻譯而影響其表達(dá),對60%以上的人類基因具有調(diào)控作用〔4〕。miRNA的異常表達(dá)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等行為,在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。miRNA的作用機(jī)制是通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)的靶位點(diǎn)結(jié)合,影響靶基因的穩(wěn)定性和翻譯。競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA),包含了與miRNA靶基因相同的miRNA應(yīng)答元件(MRE),ceRNA分子能夠與miRNA靶基因競爭性結(jié)合同一個(gè)miRNA,進(jìn)而影響 miRNA 對靶基因mRNA表達(dá)與翻譯的調(diào)控〔5〕。ceRNA能由lncRNA、mRNA、假基因等充當(dāng),與miRNA形成ceRNA網(wǎng)路,能夠?qū)?xì)胞的功能和行為等起到調(diào)節(jié)作用,在CC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用〔6〕。

在腫瘤基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中,CC的RNA測序、miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及患者的臨床信息已被收錄。已有研究利用ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析,提示母性表達(dá)(MEG)3、具有1型血小板反應(yīng)蛋白基序9的ADAM金屬肽酶的反應(yīng)RNA(ADAMTS9-AS)2、乙醇脫氫酶(ADH)7、退樣化家族成員(VGLL)3、細(xì)胞色素P450家族26亞家族B成員(CYP26B)1、miR-141、miR-96、miR-3065、miR-330和miR-499a等在CC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用〔7～9〕。本研究擬利用生物信息學(xué)方法對癌癥基因組圖譜(TCGA)中收錄的CSCC和癌旁組織的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs分析,通過生存分析篩選預(yù)后相關(guān)的miRNAs,并構(gòu)建預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò),從而探索CSCC預(yù)后相關(guān)miRNA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1樣本信息和RNA序列分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載CC患者的臨床信息和RNA表達(dá)數(shù)據(jù),并篩選CSCC患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)組織學(xué)診斷不是CSCC;(2)沒有完整的數(shù)據(jù)(包括性別、年齡和生存狀況)。本研究共選擇307個(gè)患者的臨床信息納入研究,對CSCC患者的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,并在R軟件中進(jìn)行歸一化處理。其中,miRNA、mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)分別包括254和252個(gè)腫瘤樣本組織,對照均為3個(gè)鄰近的非腫瘤樣本組織。

1.2差異表達(dá)分析 R軟件中的“l(fā)imma”包用于分析差異表達(dá)的mRNA、lncRNA和miRNA。差異表達(dá)的mRNA和lncRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)為|差異倍數(shù)(FC)|>2.0 和P<0.01;差異表達(dá)miRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|FC|>2.5 和P<0.01。P值經(jīng)過假陽性發(fā)生率(FDR)校正。

1.3功能富集分析 使用R軟件中的“ Cluster Profiler”包對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行功能富集分析,篩選出顯著水平(P<0.01)的基因本體論(GO)生物學(xué)過程和京都基因和基因組百科全書(KEGG)途徑。

1.4生存分析 差異表達(dá)的miRNA與CSCC預(yù)后的相關(guān)性通過結(jié)合臨床數(shù)據(jù)及使用基于Kaplan-Meier曲線的R軟件中“survival”包來進(jìn)行分析。

1.5ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R軟件中“GDCRNATools”包〔10〕構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)庫選擇StarBase,ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)lncRNAs與mRNAs表達(dá)呈正相關(guān),判斷標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)系數(shù)>0.3和P<0.05;(2)lncRNAs和mRNAs具有與同一個(gè)miRNA結(jié)合的相同結(jié)合位點(diǎn)。利用Cytoscape3.6.1對ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1CSCC中差異表達(dá)的miRNA鑒定 CSCC中106個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中70個(gè)上調(diào),36個(gè)下調(diào)。見圖1。表達(dá)量上調(diào)的前5個(gè)miRNA分別為hsa-miR-205-5p、hsa-miR-944、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-203b-3p;表達(dá)量下調(diào)的前5個(gè)miRNA分別為hsa-miR-204-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-10b-5p。

綠點(diǎn):上調(diào)的miRNA分子;紅點(diǎn):下調(diào)的miRNA分子圖1 CSCC中差異表達(dá)miRNAs的火山圖

2.2CSCC中與生存相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs的篩選 通過生存分析發(fā)現(xiàn),9個(gè)差異表達(dá)miRNA分子與CSCC預(yù)后具有相關(guān)性,分別是hsa-miR-425-5p、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-142-3p。見圖2。

圖2 CSCC預(yù)后相關(guān)miRNA分子的篩選與分析

2.3CSCC預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了更好地理解預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)的miRNA在CSCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,根據(jù)ceRNA的工作原理,結(jié)合miRNA靶位點(diǎn)的預(yù)測,成功構(gòu)建出一個(gè)由5個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)(hsa-miR-425-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-142-3p)、132個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)、44個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)和181條邊組成的lncRNA-miRNA-mRNAceRNA網(wǎng)絡(luò)。見圖3。

橢圓形代表mRNA,三角形代表miRNA,菱形代表lncRNA圖3 CSCC預(yù)后相關(guān)miRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.4CSCC預(yù)后相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的GO和 KEGG分析 GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)CSCC預(yù)后相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)主要涉及蛋白結(jié)合、生長因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的活化、DNA特異序列的結(jié)合等分子功能;質(zhì)膜、細(xì)胞核等細(xì)胞組分;轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、心臟發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、心內(nèi)膜緩沖發(fā)育等生物學(xué)過程。KEGG信號通路分析顯示,該網(wǎng)絡(luò)主要參與環(huán)磷酸鳥苷酸-蛋白激酶(cGMP-PKG)信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路、叉頭框蛋白(Fox)O信號通路等的調(diào)控。見圖4。

圖4 CSCC預(yù)后相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的GO和 KEGG分析

3 討 論

預(yù)后是惡性腫瘤治療過程中非常重要的評價(jià)指標(biāo)。miRNAs作為一類細(xì)胞基因表達(dá)、蛋白翻譯等過程中重要調(diào)控分子,能夠參與細(xì)胞癌變過程的調(diào)控,并且影響腫瘤治療后的預(yù)后評價(jià)。本次研究中篩選獲得了9個(gè)與CSCC預(yù)后密切相關(guān)的miRNAs分子。在以往研究中,這9個(gè)miRNAs分子中一些已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與不同器官腫瘤的預(yù)后相關(guān),如miR-425-5p與肝細(xì)胞癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、CC等預(yù)后顯著相關(guān)〔11～14〕;miR-142-3p與鼻咽癌、腎癌預(yù)后顯著相關(guān)〔15,16〕;miR-145-3p和miR-145-5p與前列腺癌預(yù)后密切相關(guān)〔17〕;miR-142-3p與腎癌預(yù)后顯著關(guān)聯(lián)〔16〕;miR-200c-3p的低表達(dá)預(yù)示著胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后較差〔18〕;miR-1307-3p在胃癌中的表達(dá)上調(diào)能夠作為預(yù)測預(yù)后評價(jià)的指標(biāo)〔19〕。由此可見,這組miRNAs在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,并且能夠影響腫瘤預(yù)后,而本研究發(fā)現(xiàn)這組miRNA分子與CSCC預(yù)后密切相關(guān),提示這些分子其中一個(gè)或幾個(gè)的組合可能參與CSCC預(yù)后調(diào)控,可能作為預(yù)后評價(jià)的指標(biāo),為CSCC預(yù)后的研究提供了新的靶標(biāo),有利于CSCC預(yù)后的進(jìn)一步研究。

ceRNA作為一種新的基因表達(dá)調(diào)控模式,與miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相比,ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為精細(xì)和復(fù)雜,通過構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能找到調(diào)控miRNA功能的影響因子。Sun等〔12〕研究表明,miR-425-5p在CC患者的癌組織、外周血中均比對照明顯升高,與腫瘤的分級、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其高表達(dá)預(yù)示預(yù)后較差,這與本研究結(jié)果一致。但目前尚未有miR-425-5p參與CC預(yù)后調(diào)控的機(jī)制研究。本研究經(jīng)過生物信息學(xué)的方法探索到miR-425-5p可能通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制實(shí)現(xiàn)對預(yù)后的調(diào)控。其中,AC104083.1、EPB41L4A-AS1、KLF3-AS1等15個(gè)lncRNA分子能夠作為ceRNA結(jié)合于miR-425-5p,影響其對ArfGAP與FG重復(fù)(AGFG)2、色盒(CBX)6、肌動(dòng)蛋白絲切蛋白(CFL)2等15個(gè)靶蛋白分子的轉(zhuǎn)錄與翻譯,從而實(shí)現(xiàn)對疾病預(yù)后的調(diào)控。

在miR-200c-3p的相關(guān)研究中,Liu等〔20〕先前通過生物信息學(xué)分析表明其與CC預(yù)后顯著相關(guān),與本研究結(jié)果相吻合,本研究通過構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)BAIAP2-AS1、EPB41L4A-AS1、FTX等26個(gè)lncRNA分子可能以ceRNA的作用方式結(jié)合于miR-200c-3p上,并且影響miR-200c-3p的靶基因ANLN、氯離子通道蛋白(ANO)6、適配器相關(guān)蛋白復(fù)合物亞基sigma(AP1S)2等105個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對疾病預(yù)后的調(diào)控。Li等〔21〕研究顯示,miR-142-3p在CC中低表達(dá),并且與國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度顯著相關(guān),生存分析表明低表達(dá)miR-142-3p的患者具有更差的預(yù)后。但是,在本研究中,雖然miR-142-3p在CSCC中顯示高表達(dá),但是低表達(dá)miR-142-3p的患者具有更差的預(yù)后,這與先前的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),MAGI2-AS3、MEG3、MIR100HG等20個(gè)lncRNAs可能作為ceRNA調(diào)控miR-142-3p對ATPase肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)(ATP2A)2、BTB域和CNC同系物(BACH)2、堿性核蛋白(BNC)2等37個(gè)靶基因的作用,從而影響CSCC患者的預(yù)后。MiR-155-5p和miR-145-5p與CSCC預(yù)后的相關(guān)性尚未見報(bào)道,本研究屬于首次表明其與CSCC預(yù)后的相關(guān)性,可能作為預(yù)后指標(biāo)評價(jià)患者預(yù)后情況。除了發(fā)現(xiàn)miR-155-5p和miR-145-5p與CSCC預(yù)后相關(guān)外,本研究也找到了39個(gè)和23個(gè)lncRNAs可能分別作為miR-145-5p和miR-155-5p的ceRNA,分別調(diào)控56個(gè)和41個(gè)靶基因的表達(dá)。

綜上,雖然尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù),但是利用生物信息學(xué)方法篩選獲得了9個(gè)可能與CSCC顯著相關(guān)的miRNA分子,并且成功構(gòu)建了預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò),探索這些預(yù)后相關(guān)miRNA分子可能的作用機(jī)制,這為CSCC預(yù)后靶標(biāo)的探索及影響預(yù)后作用機(jī)制的研究提供了新靶點(diǎn)和線索。