汪紫薇,陳坤英,張 珂,胡婕倫,聶少平,周興濤

(南昌大學食品科學資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌 330047)

結直腸癌是一種全球性消化道惡性腫瘤,同時也是醫(yī)學史上巨大的挑戰(zhàn)之一[1]。2020年,WHO國際癌癥研究機構公布的數(shù)據(jù)表明,全球人口中有193多萬人被診斷為結直腸癌,占全球所有新診斷癌癥的9.7%。中國人口總數(shù)中被新確診為結直腸癌的患者超過55萬,占中國新確診癌癥人數(shù)的12.2%,另外,在中國女性群體中,因為結直腸癌而死的人數(shù)僅次于肺癌致死人數(shù)[2]。結直腸癌已成為中國女性癌癥死亡的第二大殺手。由于結直腸癌的癥狀多出現(xiàn)在中晚期,因此大多數(shù)患者在中晚期才被確診,錯過最佳治療時機,這導致結直腸癌的死亡率居高不下[3]。研究表明,結直腸癌的致死率和發(fā)生率在癌癥中排名前三[4]。結直腸癌的常見治療方法是手術切除和化療,但是手術切除無法徹底清除腫瘤,而且化療伴有腸功能障礙和神經(jīng)病變等副作用,嚴重損害患者的身體[3]。因此,開發(fā)低副作用的天然來源活性成分是對抗結直腸癌癥的當務之急[5,6]。

茶樹菇(Agrocybecylindracea)隸屬真菌界,又名柱狀田頭菇、茶菇、楊樹菇、茶薪菇、柱狀環(huán)銹傘[7]等,廣泛分布在亞熱帶和北溫帶地區(qū)[7]。我國設有多個茶樹菇生產(chǎn)地,比如主要生產(chǎn)干菇的福建古田縣和江西、生產(chǎn)鮮菇的昆明和成都等地[8]。茶樹菇是一種兼具口感、香味、營養(yǎng)和藥用價值的食用菌[9],富含多種人體必需氨基酸、大量的蛋白質、豐富的B族維生素和多種礦質元素鉀、鈉、鎂、鋅[8],號稱“中華神菇”。大量研究發(fā)現(xiàn),茶樹菇在抗腫瘤、抗氧化、抑菌和免疫調節(jié)等方面具有非常好的潛在研究價值[10-13]。茶樹菇多糖是從茶樹菇中提取出的主要活性成分之一[14]。研究證明茶樹菇多糖對人類疾病的研究表現(xiàn)出重要的生理研究價值。例如,茶樹菇多糖顯著地抑制了小鼠體內的腹水瘤和植入的肉瘤,升高了環(huán)磷酰胺作用的小鼠體內白細胞數(shù)[15]。茶樹菇多糖通過腹腔注射進入小鼠,顯著增加了小鼠免疫器官脾臟的重量,同時顯著增強了小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能,提高了小鼠免疫功能[12]。在體外,熱水法提取的茶樹菇多糖對多種癌細胞具有明顯的抗增殖的活性作用[16]。

線粒體是參與能量供應、生存信號傳遞、鐵和鈣緩沖、活性氧信號傳遞以及類固醇激素合成的多任務細胞器[17]。為了確保所有這些任務都能有效地完成,線粒體在任何時候都需要保持穩(wěn)態(tài)。ROS是細胞內超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫的統(tǒng)稱,主要來源于線粒體呼吸鏈[18]。研究發(fā)現(xiàn),正常水平的ROS是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一個必要條件,而過量的ROS產(chǎn)生則會引發(fā)細胞凋亡、損傷及死亡[19]。其中ROS積累誘導的凋亡是通過觸發(fā)線粒體通透性過渡孔的開放,影響線粒體功能,釋放促凋亡因子造成的[20]。

本課題組前期的研究中,對茶樹菇多糖的組成成分和多糖結構進行了研究[14]。已有研究表明茶樹菇多糖具有抗腫瘤活性,但其對結直腸癌細胞的功能活性作用機制尚不清楚[16]。本研究通過體外細胞實驗探究了茶樹菇多糖抑制結直腸癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

小鼠結直腸癌細胞CT26和大鼠正常腸上皮細胞IEC-6,中國上?？茖W院細胞庫;人結直腸癌細胞HCT-116和HCT-116細胞專用培養(yǎng)基,中國武漢普諾賽生物公司;茶樹菇多糖(糖含量81%、蛋白含量4.7%,提取方法和檢測方法已報道[14]),南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室;CCK-8試劑盒,上海Dojindo Molecular Technologies公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、4%多聚甲醛、吖啶橙-溴化乙錠(AO-EB)、結晶紫染液、Hochest、Trizol試劑和PBS緩沖液片劑,北京索萊寶公司;牛血清蛋白(FBS),以色列Bioind公司;雙氧水,中國西隴公司;線粒體壓力測定試劑盒,美國Agilent Technologies公司;Mito-Tracker Red熒光探針,美國Thermo Fisher Scientific公司;Dihydroethidium(DHE)熒光染料,英國Abcam公司;N-acetyl-L-cysteine(NAC),上海碧云天公司。

1.2 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱(SHP-150),上海森信實驗儀器公司;CO2培養(yǎng)箱(HERACELL 150、BB150)和酶標儀(Variouskan Flash),美國Thermo Fisher Scientific公司;低溫高速離心機(3K15),德國Sigma公司;倒置熒光顯微鏡(CKX41),日本奧林巴斯公司;超純水凈化系統(tǒng)(Milli-Q),美國Milipore公司;超凈工作臺,蘇州AIRTECH公司;凝膠成像系統(tǒng)(Chemi XRS+),美國Bio-rad公司;海馬能量分析儀(Seahorse XF),美國Agilent Technologies公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

IEC-6、CT26和HCT-116細胞分別使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)、RPMI培養(yǎng)基(含15% FBS)和HCT-116細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代步驟:待細胞匯合率達到80%左右,倒掉舊培養(yǎng)基,無菌PBS清洗兩遍,胰蛋白酶消化(不同細胞消化時間不一樣,細胞開始緩慢脫落時終止消化),再離心收集細胞,按一定比例進行傳代。細胞在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞增殖活性檢測

2.2.1 CCK-8實驗

細胞接種于96孔板中(IEC-6:1.5×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)24 h,0.75×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)48 h;HCT-116:2.5×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)24 h,1.25×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)48 h;CT26:2×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)24 h,1×104個細胞/孔/多糖培養(yǎng)48 h)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置5個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。吸走舊培養(yǎng)基,加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基混合液,繼續(xù)孵育40 min。使用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度值(OD)。

2.2.2 細胞克隆形成實驗

CT26細胞(800個/孔)接種于六孔板中,每組設置3個平行。細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后,將培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸走舊培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛作用10 min。用PBS洗兩遍細胞,加入結晶紫染液作用3 min。用PBS再次洗兩遍細胞后,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.3 轉錄組分析(RNA-seq)

HCT-116細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中(4.5×106個細胞)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置3個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸走舊培養(yǎng)基,細胞用PBS洗一遍,加入Trizol試劑。通過吹打細胞使其破裂,釋放RNA。最后所有樣本通過干冰運送至天津諾禾生物信息科技有限公司完成后續(xù)測序步驟。

通過HTSeq 0.12.4軟件計算測序數(shù)據(jù),根據(jù)| log2(fold change) | ≥ 0.3786和P-value<0.05篩選得到差異表達基因。在KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)網(wǎng)站上分析信號通路變化[6]。利用TBtools v1.108軟件繪制熱圖[21]。

2.4 ROS檢測

HCT-116細胞接種于十二孔板中(3×105個細胞/孔)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置3個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。H2O2(400 μmol·L-1,預處理2 h)作為陽性對照。吸走舊培養(yǎng)基,加入含1 μmol·L-1DHE熒光染料的培養(yǎng)基混合液,避光孵育30 min。使用倒置熒光顯微鏡觀察ROS生成情況。若ROS增加,紅色熒光將增強;若ROS減少,紅色熒光將減弱。使用Image J軟件進行半定量分析。

2.5 線粒體膜電位檢測

HCT-116細胞接種于十二孔板中(3×105個細胞/孔)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置3個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。H2O2(400 μmol·L-1,預處理2 h)作為陽性對照。吸走舊培養(yǎng)基,加入預熱10 min后的含100 nmol·L-1Mito-Tracker Red的培養(yǎng)基混合液,繼續(xù)孵育30 min。吸走培養(yǎng)基,加入Hoechst孵育30 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位變化。若線粒體膜電位上升,紅色熒光將增強;若線粒體膜電位下降,紅色熒光將減弱。使用Image J軟件進行半定量分析。

2.6 線粒體壓力測試

通過海馬能量分析儀測量氧消耗率(OCR),基于OCR分析線粒體各項指標(ATP產(chǎn)生量、基礎呼吸值、質子漏、最大呼吸值、非線粒體呼吸值和線粒體備用呼吸能)[22]。HCT-116細胞接種在海馬能量分析儀配套的細胞培養(yǎng)小孔板中(8×103個細胞/孔)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置3個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照線粒體壓力測定試劑盒說明書操作,在測量前一天晚上活化探針板。測量當天,細胞使用含10 mmol·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1丙酮酸、2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI(pH為7.4,37 ℃預熱)清洗,隨后放入探針板,將寡霉素、FCCP、抗霉素A和魚藤酮以終濃度為1.5、1、0.5和0.5 μmol·L-1注射到相應的細胞培養(yǎng)孔中,細胞放入海馬能量分析儀中測量各項指標。最后采用軟件Wave 2.6.0對OCR數(shù)據(jù)進行分析。

2.7 吖啶橙-溴化乙錠(AO-EB)染色實驗

HCT-116細胞接種于十二孔板中(3×105個細胞/孔)培養(yǎng)過夜使其貼壁,每組設置3個平行,然后將舊培養(yǎng)基更換成茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL AO-EB染料(AO與EB等體積混合)染色5 min。使用倒置熒光顯微鏡拍照。凋亡細胞的熒光明顯更亮。共有四種細胞:活細胞(染色質呈綠色、結構正常)、早期凋亡細胞(染色質呈綠色、結構收縮)、晚期凋亡細胞(染色質呈橙紅色、結構收縮)和非凋亡的死亡細胞(染色質橙紅色、結構正常)。

2.8 茶樹菇多糖聯(lián)合NAC作用于HCT-116細胞

采用AO-EB染色法檢測茶樹菇多糖聯(lián)合NAC(ROS抑制劑)對HCT-116細胞凋亡的影響,方法同2.7。共設立4個組別:正常組(NC);茶樹菇多糖處理組(200、300、400 μg·mL-1);抑制劑組(NAC):100 μmol·L-1的NAC預處理30 min;茶樹菇多糖聯(lián)合NAC處理組(200、300、400 μg·mL-1+NAC):100 μmol·L-1的NAC預處理30 min后,然后加入茶樹菇多糖濃度分別為0、200、300和400 μg·mL-1的培養(yǎng)基。

2.9 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8軟件對各組進行方差分析(雙或單因素),顯著性采用Dunnett或Tukey多重比較檢驗確定。P<0.05:均值差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計差異顯著性為:*,P<0.05,顯著;**,P<0.01,極顯著;#,P<0.001,超顯著。結果以至少3次獨立實驗的均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。

3 結果與分析

3.1 茶樹菇多糖抑制結直腸癌細胞增殖活性

大量研究表明,多糖具有抗腫瘤活性[23]。本研究中CCK-8檢測結果表明,茶樹菇多糖顯著抑制結直腸癌細胞HCT-116和CT26增殖活力,并呈濃度和時間依賴關系。與正常組相比,HCT-116細胞在400 μg·mL-1茶樹菇多糖處理24和48 h后,細胞活力分別降低至65%和40%(圖1A),CT26細胞在400 μg·mL-1茶樹菇多糖處理24 h和48 h后,細胞活力分別降低至66%和50%(圖1B)。此外,細胞克隆形成實驗結果表明,CT26細胞增殖能力在300和400 μg·mL-1茶樹菇多糖組受到明顯抑制(圖1C和D)。有趣的是,茶樹菇多糖對正常腸上皮細胞IEC-6增殖無抑制作用(圖1E)。上述結果表明,茶樹菇多糖具有抑制結直腸癌細胞增殖的活性,且對正常腸上皮細胞無副作用。

3.2 茶樹菇多糖下調HCT-116細胞氧化磷酸化通路

為了探究茶樹菇多糖抑制HCT-116細胞增殖的機制,本研究進行了RNA-seq實驗。結果表明茶樹菇多糖顯著下調了氧化磷酸化和呼吸電子傳遞等通路(圖2A)。此外,如圖2B所示,MT-ND1、MT-ND2等氧化磷酸化相關基因的轉錄水平顯著下降(離散色階:紅色表示基因高表達,藍色表示基因低表達)。研究表明,氧化磷酸化通路的下調會導致腫瘤細胞增殖能力下降[24]。例如,Sara等研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過損害氧化磷酸化途徑阻止轉移性HeLa癌細胞生長[25]。綜上分析,茶樹菇多糖抑制HCT-116細胞增殖的機制可能涉及氧化磷酸化通路的下調。

t/h t/h

將茶樹菇多糖(0、200、300、400 μg·mL-1)作用于HCT-116細胞(A)、CT26細胞(B)和IEC-6(E)細胞24、48 h,采用CCK-8法檢測細胞活力;(C)CT26細胞克隆形成實驗的代表性圖像;(D)細胞克隆數(shù)定量。

(A)茶樹菇多糖抑制HCT-116細胞增殖的相關下調通路;(B)茶樹菇多糖影響HCT-116細胞中氧化磷酸化通路的熱圖。

3.3 茶樹菇多糖誘導HCT-116細胞ROS積累

研究表明,氧化磷酸化受損通常會引起ROS過度產(chǎn)生,而ROS積累又會破壞線粒體電子傳遞鏈,進而抑制氧化磷酸化,形成一個“惡性循環(huán)”[26-27]。因此,為了探究RNA-seq分析結果中茶樹菇多糖下調的氧化磷酸化通路是否與ROS積累之間存在關系,本研究采用DHE熒光染料檢測HCT-116細胞中ROS的變化。結果如圖3A所示,隨著茶樹菇多糖濃度增加,熒光明顯增強。經(jīng)定量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),300和400 μg·mL-1茶樹菇多糖在HCT-116細胞中分別誘導了1.4、1.7倍以上的ROS(圖3B)。綜上分析,茶樹菇多糖顯著誘導了ROS的積累。

(A)DHE熒光染料染色后的代表性圖像

μg·mL-1(B)ROS平均熒光強度的定量

3.4 茶樹菇多糖誘導HCT-116細胞線粒體膜電位喪失

在癌細胞中,高水平的ROS表明線粒體功能可能已經(jīng)受損[28]。此前,Zhang等人發(fā)現(xiàn)蘆薈凝膠葡甘露聚糖誘導結直腸癌細胞CT26中ROS積累和線粒體膜電位下降進而導致線粒體功能障礙[29]。線粒體膜電位是評估線粒體功能的常用參數(shù)。因此,本研究采用Mito-Tracker Red熒光探針檢測線粒體膜電位變化。結果如圖4A所示,隨著茶樹菇多糖濃度增加,紅色熒光明顯減弱。經(jīng)定量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),茶樹菇多糖顯著降低了HCT-116細胞線粒體膜電位,尤其是300和400 μg·mL-1茶樹菇多糖組線粒體膜電位分別為正常組的0.5倍和0.4倍左右(圖4B)。綜上分析,茶樹菇多糖顯著誘導了HCT-116細胞線粒體膜電位喪失。

(A)Mito-Tracker Red和Hoechst染色后的代表性圖像;(B)線粒體膜電位定量分析。

3.5 茶樹菇多糖誘導了HCT-116細胞線粒體功能障礙

線粒體是細胞內產(chǎn)能細胞器。線粒體氧化磷酸化是細胞獲取能量的主要途徑之一[30]。ROS增加以及氧化磷酸化抑制可能導致細胞能量供應不足[31]。因此,本研究采用海馬能量分析儀檢測OCR完成線粒體壓力測試。OCR檢測原理如圖5A。結果如圖5B-H所示,400 μg·mL-1茶樹菇多糖明顯降低了HCT-116細胞中ATP產(chǎn)生量、基礎呼吸值、最大呼吸值、非線粒體呼吸能和線粒體備用呼吸能。上述結果表明,茶樹菇多糖導致HCT-116細胞線粒體的產(chǎn)能能力、能量儲備等功能下降,即功能發(fā)生障礙。

t/min(A)OCR原理圖 t/min (B)400 μg·mL-1 茶樹菇多糖處理HCT-116細胞后OCR的變化

(C)非線粒體呼吸能定量分析 (D)基礎呼吸值定量分析

(E)線粒體備用呼吸能定量分析 (F)最大呼吸值定量分析

(G)質子漏定量分析 (H)ATP產(chǎn)生量定量分析

3.6 茶樹菇多糖通過ROS-線粒體功能障礙通路誘導HCT-116細胞凋亡

線粒體功能障礙會導致促凋亡因子(細胞色素c等)釋放從而引起凋亡的發(fā)生[32,33]。因此,本研究采用AO-EB染色法檢測細胞凋亡的發(fā)生。如圖6A所示,隨著茶樹菇多糖濃度的增加,HCT-116細胞的形態(tài)發(fā)生明顯皺縮并且橙色熒光明顯增強。統(tǒng)計分析(圖6B)結果表明,茶樹菇多糖誘導了HCT-116細胞凋亡。為了進一步驗證茶樹菇多糖誘導的ROS在HCT-116細胞凋亡中的作用,使用NAC預處理來抑制ROS的產(chǎn)生。結果如圖6A和B所示,400 μg·mL-1茶樹菇多糖組中細胞凋亡比例為24%,經(jīng)NAC預處理的400 μg·mL-1茶樹菇多糖組中的細胞凋亡比例為18.6%,兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義。以上結果表明,茶樹菇多糖通過促進ROS過量積累導致線粒體功能障礙,進而誘導HCT-116細胞凋亡。

(A)AO-EB染色檢測細胞凋亡 (B)AO-EB染色定量

4 結論

由于結直腸癌的高發(fā)率和不斷上升的死亡率,開發(fā)治療結直腸癌的新藥物迫在眉睫。相對于化療藥物的高毒副作用,高效、安全的天然活性物質逐漸進入研究者的視野。本研究發(fā)現(xiàn)天然來源的茶樹菇多糖具有顯著抑制結直腸癌細胞HCT-116和CT26增殖的功能活性作用,并且抑制效果隨多糖濃度和處理時間增加而增強。值得注意的是,茶樹菇多糖對正常腸上皮細胞IEC-6無毒害作用。此外,茶樹菇多糖顯著下調了HCT-116細胞氧化磷酸化通路以及誘導了ROS的生成。ROS過量積累導致線粒體膜電位喪失以及線粒體功能障礙,從而誘導HCT-116細胞凋亡,并最終抑制其增殖。重要的是,抗氧化劑NAC通過清除ROS驗證了茶樹菇多糖通過ROS-線粒體功能障礙通路誘導HCT-116細胞凋亡這一結果。本研究為進一步開發(fā)和應用茶樹菇多糖提供了理論基礎。