廖 洋，張 娜，譚寧華，陳凌云

（中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198）

系統(tǒng)發(fā)育也被稱為系統(tǒng)發(fā)生、種系發(fā)生、系統(tǒng)進化、系統(tǒng)發(fā)展，是指單個生物或生物類群的演化過程[1]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生物和醫(yī)學(xué)的多個領(lǐng)域[2]，如：生物分類、蛋白質(zhì)或基因家族分類、物種與基因的關(guān)系、物種形成過程、物種遷徙模式、人口結(jié)構(gòu)變化[3]、昆蟲保護[4]；疾病診斷、疾病與病毒的進化過程及二者的相似性[5]、疾病感染途徑重建[6]等。測序技術(shù)的不斷發(fā)展和測序成本的持續(xù)下降，使得越來越多的生物學(xué)數(shù)據(jù)噴涌而出，為系統(tǒng)發(fā)育研究提供了充足的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

我國藥用植物資源豐富[7-8]，使用藥用植物防病治病、保健養(yǎng)生已有幾千年的歷史[9-11]。隨著社會的發(fā)展，對藥用植物資源的需求也在增加，但人類活動的破壞和無節(jié)制的濫用，以及相關(guān)技術(shù)的限制，使得許多藥用植物還未得到很好的開發(fā)與利用，就已經(jīng)滅絕或即將面臨滅絕[12]。因此，加快藥用植物資源的保護迫在眉睫。

本文對系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物研究中的應(yīng)用進行綜述，以期讓更多的藥用植物研究者關(guān)注了解系統(tǒng)發(fā)育，從而更好的實現(xiàn)藥用植物資源的保護、開發(fā)和可持續(xù)利用。

1 系統(tǒng)發(fā)育的歷史

系統(tǒng)發(fā)育這一學(xué)術(shù)名詞最先由德國生物學(xué)家Ernst Haeckel 基于形態(tài)學(xué)概念而提出[13]，迄今，已發(fā)展為一門獨立學(xué)科——系統(tǒng)發(fā)育學(xué)或分子系統(tǒng)學(xué)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果通常以系統(tǒng)發(fā)育樹展示[14]。

系統(tǒng)發(fā)育研究的歷史起源于1859 年達爾文在《物種起源》中發(fā)表的進化論。進化論的發(fā)表促使植物學(xué)家開始考慮植物物種之間的親緣關(guān)系，從而開啟了系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)的研究[15]。20 世紀中葉之前，植物系統(tǒng)發(fā)育圍繞植物的外部形態(tài)特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)而展開。20 世紀中葉之后，隨著生物學(xué)的發(fā)展進入分子時代，研究者開始從分子水平去研究植物進化、分類等科學(xué)問題，系統(tǒng)發(fā)育進入了一個全新的時代。

20 世紀80 年代，數(shù)學(xué)思維、計算機技術(shù)以及居群思想的引入，對系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生了極大的影響，人們對物種的認識有了新的理解，對種間關(guān)系、變異、分化、物種的環(huán)境適應(yīng)有了更深的認識。再到20 世紀90 年代，分子生物學(xué)在方法上有了很大的突破，極大地推動了植物系統(tǒng)發(fā)育的發(fā)展，系統(tǒng)發(fā)育研究分為種上和種下兩個水平，誕生了分子系統(tǒng)學(xué)，為種上水平；分子生態(tài)學(xué)以及譜系地理學(xué)，隸屬種下水平。

進入21 世紀，二代、三代測序技術(shù)的發(fā)展，使得DNA 數(shù)據(jù)爆發(fā)式增長，推動了植物系統(tǒng)發(fā)育和分類研究進入“黃金時代”，研究者們對植物系統(tǒng)發(fā)育的研究不再局限于DNA 分子標記，而是開始使用不同類型的基因組數(shù)據(jù)，如葉綠體基因組、線粒體基因組、核基因組[15-17]。

系統(tǒng)發(fā)育作為強有力的分析工具，已經(jīng)應(yīng)用到多個學(xué)科，如：化學(xué)[18]、生物地理學(xué)[19-20]、生態(tài)學(xué)[21-22]、發(fā)育學(xué)[23]、流行病學(xué)[24-25]等。

2 系統(tǒng)發(fā)育主要研究方法及分析流程

依據(jù)不同的計算方式，系統(tǒng)發(fā)育重建方法可分為兩大類[26]：一類是字符運算法 (如：數(shù)字、堿基、氨基酸等字符)又可細分為三種主要方法，即最大似然法 (ML)、最大簡約法 (MP)、貝葉斯推斷法 (BI)；一類是距離矩陣法，該方法依賴于計算數(shù)據(jù)集中每對序列之間的遺傳距離，并通過聚類算法從生成的距離矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[27]。距離矩陣法也可細分為兩種主要方法[28-29]，即不加權(quán)對群分析法 (UPGMA) 和鄰接法 (NJ)。不同建樹方法[3]的優(yōu)缺點比較見表1。這些方法都有各自的使用范圍和使用條件，如：最大簡約法適用于序列堿基差異小、堿基總數(shù)大、所有堿基變異速率相近、較少的堿基轉(zhuǎn)換、信息位點較多的序列矩陣。所以通常需要研究者綜合考慮這幾種方法建立可靠的系統(tǒng)發(fā)育樹，以提高分析結(jié)果的可性度。

表1 系統(tǒng)發(fā)育重建不同方法比較Tab.1 Comparison of different methods of phylogenetic reconstruction

早期的系統(tǒng)發(fā)育重建多為根據(jù)形態(tài)和生理特征來推斷進化關(guān)系，分子生物學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展使得系統(tǒng)發(fā)育重建多采用序列數(shù)據(jù)。基于序列的系統(tǒng)發(fā)育重建可分為4 個主要步驟：一、待分析序列數(shù)據(jù)的獲取；二、序列比對；三、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建；四、系統(tǒng)發(fā)育樹可視化[30-31]。簡略流程圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育分析主要步驟及分析工具Fig.1 Main steps of phylogenetic analysis and analytical tools

3 系統(tǒng)發(fā)育分析常用的組學(xué)數(shù)據(jù)類型

基因組時代的系統(tǒng)發(fā)育分析多采用組學(xué)數(shù)據(jù)，總體而言，系統(tǒng)發(fā)育分析常用的組學(xué)數(shù)據(jù)類型可以歸為三大類，分別是葉綠體基因組數(shù)據(jù)，線粒體基因組數(shù)據(jù)以及核基因組數(shù)據(jù)。

葉綠體是植物特有的半自主細胞器，是植物進行光合作用的場所，對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。葉綠體基因組序列結(jié)構(gòu)較為保守，不易發(fā)生重組，為單親母系遺傳，保留了很多植物進化過程中的遺傳信息，易于進行序列比對，是研究植物系統(tǒng)發(fā)育很好的分子數(shù)據(jù)資源[32-33]。進行系統(tǒng)發(fā)育研究常用的葉綠體基因組數(shù)據(jù)主要有rbcL、matK、psbA-trnH序列。

線粒體是存在于大多數(shù)真核細胞中的半自主性細胞器，參與細胞的眾多生物過程，如能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、細胞分化、細胞信息傳遞、細胞凋亡等，具有許多非常重要的生理生化功能[34]。不同于葉綠體基因組，線粒體基因組結(jié)構(gòu)在植物中的變化率很高，極易發(fā)生結(jié)構(gòu)重排[35-37]。植物線粒體基因組具有保守的核苷酸替代速率，進化緩慢，因此很少用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究，但卻十分適合動物系統(tǒng)發(fā)育研究[38-39]。

核基因組與葉綠體基因組和線粒體基因組相比，具有更豐富的遺傳信息，為雙親遺傳，能揭示更為復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在系統(tǒng)發(fā)育研究中的潛力更大，是未來系統(tǒng)發(fā)育研究的主流方向[17]。進行系統(tǒng)發(fā)育研究常用的核基因組數(shù)據(jù)主要有ITS 序列，ITS序列又包括ITS1 和ITS2 序列。

4 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物中的應(yīng)用

4.1 系統(tǒng)發(fā)育在藥材鑒定中的應(yīng)用

基因組序列蘊含著植物起源、進化、發(fā)育、生理、遺傳性狀等重要信息，是分子水平上破譯基因組多樣性、化學(xué)多樣性、形態(tài)多樣性的前提和基礎(chǔ)[40]。DNA 條形碼是從用于識別物種的基因組序列中提取的具有物種水平遺傳變異或差異，且包含保守側(cè)翼位點的一個或多個短基因序列[41]，是一種基于DNA序列的物種快速鑒定工具。目前在植物應(yīng)用中首選的標準條形碼有rbcL、matK、trnH-psbA、ITS、ITS2。DNA 條形碼鑒定物種是通過將未知樣品的條形碼序列與已建立的物種DNA 條形碼庫進行匹配，通過匹配率進行物種的識別，其局限性在于，如兩個或多個未知物種的條形碼序列（其中，既有已知物種，也有已知物種的混偽種）與已知物種的DNA條形碼序列匹配率很高時，依舊無法鑒定未知物種是否為真實的已知物種[41-42]。此時，將未知物種的條形碼序列與已知物種的DNA 條形碼序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，通過系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，觀察未知物種是否與已知物種聚到同一枝，從進化關(guān)系上去鑒別未知物種與已知物種的親緣關(guān)系，則可以很好地解決這一問題。

基于藥材DNA 條形碼等序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析，能從進化樹上清晰的看出枝與枝之間的親緣關(guān)系遠近（枝與枝離的越近，親緣關(guān)系越近，反之，則親緣關(guān)系越遠），從而在分子水平上對藥材極其摻雜物進行鑒定。很多植物藥材在形態(tài)特征上與摻雜物具有高度的相似性，通過肉眼很難辨別藥材真假，這就使得在藥材市場流通時存在一定的安全風(fēng)險，一些不法分子以假充真，嚴重破壞了藥材市場秩序，使用系統(tǒng)發(fā)育分析對藥材進行鑒定則能很好的解決這一問題。系統(tǒng)發(fā)育由于具有快速、高效、可靠等優(yōu)點，在藥材鑒定領(lǐng)域越來越受歡迎，使用系統(tǒng)發(fā)育分析方法進行藥材鑒定也越來越普遍。

系統(tǒng)發(fā)育可以對中藥材基源物種進行區(qū)分和鑒定，見表2。系統(tǒng)發(fā)育可以應(yīng)用于藥材及其摻雜物的鑒定，見表3。

表2 系統(tǒng)發(fā)育在中藥材基源物種鑒定中的實例Tab.2 Examples of phylogeny in the identification of basal species of herbal medicines

表3 系統(tǒng)發(fā)育在中藥材及其摻雜物鑒定中的應(yīng)用Tab.3 Applications of phylogeny in the identification of Chinese herbal medicines and its adulterants

4.2 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物親緣關(guān)系及藥材道地性鑒定中的應(yīng)用

一些藥用植物親緣關(guān)系較為復(fù)雜，藥材基源植物使用混亂、藥材道地性存在爭議，影響臨床用藥安全，使用藥用植物及其近緣物種完整或部分基因組序列數(shù)據(jù)進行比對建樹，可以通過系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果揭示藥用植物及其近緣物種的親緣關(guān)系，很好的解決基原和用藥問題。通過系統(tǒng)發(fā)育分析進行藥用植物親緣關(guān)系鑒定的實例，見表4。

表4 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物親緣關(guān)系鑒定中的應(yīng)用Tab.4 Applications of phylogeny in the identification of relatives of medicinal plants

4.3 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物及活性成分預(yù)測中的應(yīng)用

將具有某種藥理活性的藥用植物基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，可以從系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果觀察具有某種藥理活性的基因序列聚在哪一枝，從而找到具有該藥理活性的潛在藥用植物或藥理活性成分。植物通常含有多種次生代謝產(chǎn)物，而這些次生代謝產(chǎn)物往往具有豐富的生物活性，是人類對抗疾病的重要來源[60]。一些藥用植物的有效成分已經(jīng)被闡明，但某些有效成分在植物中的含量卻很低，系統(tǒng)發(fā)育研究有助于確定具有潛在藥用價值的藥用植物預(yù)測，從而找到高含量有效成分的替代資源，是藥物發(fā)現(xiàn)的有力工具。此外，通過系統(tǒng)發(fā)育分析還能縮小擬調(diào)查群體的數(shù)量，提高對目標群體的探測效率和準確率。系統(tǒng)發(fā)育對藥用植物及活性成分預(yù)測的應(yīng)用實例，見表5。

表5 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物及活性成分預(yù)測中的應(yīng)用Tab.5 Applications of phylogeny in the prediction of medicinal plants and active ingredients

4.4 系統(tǒng)發(fā)育在藥用植物生物合成中的應(yīng)用

一些化合物的生物合成通路還未闡明，同一化合物的生物合成通路在不同物種中的合成模式也不盡相同，且同一化合物在不同物種中存在與否，以及含量變化同樣具有差異?；诮M學(xué)數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將功能已知的基因序列同目標基因序列進行比對建樹，通過系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果解析參與化合物生物合成基因或基因家族的演化歷史，判斷是否發(fā)生基因轉(zhuǎn)移、基因復(fù)制、基因丟失等事件，可以很好地回答化合物在不同物種中存在與否、含量出現(xiàn)差異的原因、以及合成通路模式不同等系列問題，為化合物生物合成通路的解析提供更多的理論依據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育在生物合成中的應(yīng)用實例，見表6。

5 結(jié)語

綜上所述，利用系統(tǒng)發(fā)育分析，可以進行藥材鑒定，區(qū)分藥材真?zhèn)?，促進中藥材市場的穩(wěn)定健康發(fā)展；可以進行物種親緣關(guān)系鑒定，揭示物種的進化地位和物種間的進化關(guān)系；可以進行藥用活性成分預(yù)測，找到候選藥用化合物，為新藥篩選提供理論依據(jù)，提高研究效率；可以進行潛在藥用植物預(yù)測，擴大藥用植物資源，實現(xiàn)藥用植物資源的保護和可持續(xù)利用。除此之外，系統(tǒng)發(fā)育還可應(yīng)用于尋找國外進口藥物的國內(nèi)替代藥用資源，完善、解釋中草藥用藥經(jīng)驗等。隨著系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)的不斷發(fā)展，未來利用系統(tǒng)發(fā)育進行生物合成通路的解析可能會成為研究熱點之一，基因的起源與進化，病原體的來源與進化等問題也可能成為系統(tǒng)發(fā)育研究的主流。