王 萍，許 剛，廖予菲*，張瑞瑞，李 騰

（1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西西安 712046；3.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥葉，為我國傳統(tǒng)中藥,性溫，味辛、苦，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、外用祛濕止癢等功效，主要用于治療吐血、衄血、崩漏、月經(jīng)過多、胎漏下血、少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕等癥；外治皮膚瘙癢。醋艾炭溫經(jīng)止血，用于虛寒性出血[1]。艾葉揮發(fā)油含量較為豐富，是其主要活性成分之一，具有抑菌、平喘、鎮(zhèn)咳等作用[2-5]，已逐漸應(yīng)用到醫(yī)藥、香料、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。

目前，關(guān)于植物揮發(fā)油提取方法的研究報(bào)道較多，如：水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波萃取法等[6-9]方法，其中，水蒸氣蒸餾法具有操作簡便、成本低、污染小等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。為此，本試驗(yàn)以艾葉為研究對(duì)象，以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，研究水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的工藝參數(shù)，從而確定最佳提取條件。

1 材料

1.1 藥物與試劑

艾葉采自陜西國際商貿(mào)學(xué)院校區(qū)，由陜西國際商貿(mào)學(xué)院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的葉，陰干后粉碎。

石油醚（批號(hào)：20210628，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（批號(hào)：20210819，分析純）、氯化鈉（批號(hào)：20200105，分析純），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

BT125D 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；ZNHW 型智能恒溫電熱套(上?？婆d儀器有限公司)；FW-100 型高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取方法

取過40 目的艾葉粉末100 g，精密稱定，根據(jù)2020 年版《中國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法[10]，在加熱前于揮發(fā)油提取器中加入2.5 mL 石油醚，按照一定試驗(yàn)條件提取，收集石油醚液體，用無水硫酸鈉除去水分，置干燥至恒重的燒杯中，揮干石油醚，稱定重量，計(jì)算揮發(fā)油得率。

2.2 單因素試驗(yàn)考察揮發(fā)油提取工藝

稱取艾葉100 g，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，考察藥材粒度（＜10 目、10 目、20 目、30 目、＞30 目）、液料比（5 : 1、10 : 1、15 : 1、20 : 1、25 : 1）、浸泡時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取時(shí)間（3、4、5、6、7 h）及氯化鈉濃度（0、0.5%、1%、3%、5%、7%）對(duì)艾葉揮發(fā)油得率的影響。

2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要因素

參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，以艾葉揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，運(yùn)用 Design-Expert 軟件對(duì)影響揮發(fā)油得率的5 個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出主要因素，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels for Plackett-Burman test design

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，以藥材粒度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間為自變量，以揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，采用 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，因素水平表見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factors and levels for response surface test

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，用SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析采用 Design Expert 8.0.6。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 藥材粒度的考察 不同粒度藥材在液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察藥材粒度對(duì)揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果見圖1A。結(jié)果表明，隨著粉碎度的增加，揮發(fā)油得率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這可能是粉碎度越大，藥材粉末越小，揮發(fā)油損失的越多，由此可見，藥材粒度為＜10 目、10 目、20 目，揮發(fā)油得率有最大值。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factors test

3.1.2 液料比的考察 取艾葉粉末（10 目），加入不同液料比的3% 氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察液料比對(duì)揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果見圖1B。結(jié)果表明，隨著液料比的增加，揮發(fā)油得率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)液料比為15 : 1 時(shí)，揮發(fā)油得率最大，由此可見，液料比在10 ～ 20倍，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.3 浸泡時(shí)間的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中提取4 h，考察浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果見圖1C。結(jié)果表明，浸泡時(shí)間低于4 h，揮發(fā)油得率明顯增加，高于4 h，揮發(fā)油得率有所下降，因此，浸泡時(shí)間在3 ～ 5 h，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.4 提取時(shí)間的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中浸泡4 h，考察不同提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果見圖1D。結(jié)果表明，提取時(shí)間大于4 h，揮發(fā)油得率增加趨于平緩，說明提取4 h，基本上已將艾葉中的揮發(fā)油提取完全，因此，提取時(shí)間在3 ～ 5 h，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.5 氯化鈉濃度的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察不同濃度氯化鈉濃度對(duì)揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果見圖1E。結(jié)果表明，加入氯化鈉揮發(fā)油的得率明顯高于不加氯化鈉揮發(fā)油的得率，且氯化鈉濃度高于3%，揮發(fā)油得率增加趨于平緩，因此，氯化鈉濃度在1% ～ 5%，揮發(fā)油得率有最高值。

3.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

依據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選對(duì)揮發(fā)油影響的主要因素，每組試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Tab.3 Experimental design and results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman 模型方差分析表Tab.4 Analysis of variance of Plackett-Burman model

由表4 可以看出，藥材粒度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率有顯著性影響，其中浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響極顯著，而氯化鈉濃度對(duì)揮發(fā)油得率無顯著性影響，故而氯化鈉濃度選擇3%，藥材粒度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間為響應(yīng)面試驗(yàn)中的考察因素。

3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)

3.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 應(yīng)用 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Tab.5 Design and results of response surface test

3.3.2 模型擬合與方差分析 運(yùn)用Design -Expert8.0.6 軟件表5 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到多元回歸擬合方程Y= 0.67 + 0.005A+ 0.53B+0.24C+ 0.063D- 0.33AB- 0.015AC- 0.0025AD+0.035BC+ 0.005BD+ 0.067CD- 0.13A2- 0.086B2-0.061C2- 0.080D2，由回歸方程可知，影響因素的順序?yàn)锽 ＞C ＞D ＞A，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表Tab.6 Analysis of variance of response surface test

由表6 可知，模型P＜0.00 1，失擬項(xiàng)為0.708，說明本試驗(yàn)方法可靠，未知因素對(duì)本試驗(yàn)的結(jié)果影響較??；又由決定系數(shù)R2= 0.985 0，R2= 0.970 0，模型的變異系數(shù)CV= 3.31%，說明該模型的擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小，用此模型方程能很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。此外，表6 反映出，因素B、C、D、AB、BC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)揮發(fā)油得率有極顯著的影響，其他因素對(duì)綜合得分無顯著性影響。為進(jìn)一步研究相關(guān)變量的交互作用和確定最佳工藝提供可視化分析，利用Design-Expert 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到響應(yīng)立體分析圖譜見圖2。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response Surface and contour map of the interaction of various factors

由圖2 可知，各因素對(duì)艾葉揮發(fā)油得率均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，其中，浸泡時(shí)間與提取時(shí)間的響應(yīng)面圖最為陡峭，等高線圖呈明顯的橢圓形，表明浸泡時(shí)間與提取時(shí)間的交互作用最為顯著，這與表6的分析結(jié)果一致。

由Design-Expert 8.0.6 軟件得出的艾葉揮發(fā)油最佳提取工藝參數(shù)為藥材粒度為9.10 目，液料比為17.48 倍，浸泡時(shí)間為4.75 h，提取時(shí)間為4.73 h；考慮到操作的實(shí)際性，調(diào)整最優(yōu)條件為藥材粒度過10 目，液料比為17.5 : 1，浸泡時(shí)間為4.5 h，提取時(shí)間為4.5 h。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在氯化鈉濃度為3%的條件下，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到揮發(fā)油得率分別為0.72%、0.68%、0.71%，平均值為0.70%，RSD 為2.42%，與預(yù)測值相差0.02%，表明所選工藝穩(wěn)定性好。

4 討論

水蒸氣蒸餾法是揮發(fā)油提取的常用方法之一，但得率往往較低。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，艾葉水蒸氣蒸餾液中加入氯化鈉后，揮發(fā)油的得率明顯提高，這是因?yàn)闊o機(jī)小分子鹽的加入，改變了溶劑的極性，降低揮發(fā)油在水中的溶解度，從而提高了揮發(fā)油的得率，這與閆璽鎂等[11]研究結(jié)果一致，由此可知鹽析輔助提取揮發(fā)油的方法確實(shí)可行。

在前期實(shí)驗(yàn)研究中還發(fā)現(xiàn)，藥材粒度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率也有影響，因?yàn)樗幉姆鬯楹?，其比表面積增大，有利于提取，但粉碎度過大，粉末粒徑過于細(xì)小，造成溶液的黏稠性增大，不利于成分的擴(kuò)散，進(jìn)而提取率降低。藥材中揮發(fā)油的含量是一定的，提取溶劑太少，沒有足夠的水蒸氣，不足以將揮發(fā)油提取完全，溶劑太多，造成溶劑的浪費(fèi)。浸泡時(shí)間過短，植物細(xì)胞沒有得到充分膨脹，在短時(shí)間內(nèi)無法提取完全，浸泡時(shí)間過長，可能會(huì)造成化學(xué)成分改變；提取時(shí)間延長，有利于揮發(fā)油的提取完全，但提取時(shí)間過長，難以保證揮發(fā)油純度，從而降低揮發(fā)油得率，需要找到兩者之間的結(jié)合點(diǎn)。

Plackett-Burman 試驗(yàn)是一種從多因素中篩選對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響因素的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因素?cái)?shù)太多或部分因素不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源[12-16]。本研究中，采用該方法對(duì)影響艾葉揮發(fā)油的5 個(gè)因素進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示氯化鈉濃度在這5 個(gè)因素中對(duì)揮發(fā)油得率影響最小，因而在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察藥材粒度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等對(duì)揮發(fā)油得率的影響，進(jìn)而進(jìn)行工藝優(yōu)化。

5 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出對(duì)艾葉揮發(fā)油得率有明顯影響的因素及水平范圍，運(yùn)用Box-Behnken 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳提取工藝參數(shù)，即優(yōu)化的最佳工藝為藥材粒度為10 目、液料比為17.5 : 1、氯化鈉濃度為3%、浸泡時(shí)間為4.5 h、提取時(shí)間為4.5 h。然而在本研究中，只考察了氯化鈉對(duì)揮發(fā)油得率的影響，而其他鹽對(duì)揮發(fā)油的提取是否有同樣的影響及是否對(duì)揮發(fā)油中的化學(xué)成分有影響，還需進(jìn)一步考察。