王莉莉，李爭(zhēng)艷，陸兔林，張逸婷，張欣蕊，鮑俊浩，謝 輝*，余曉玲*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.昆明市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，云南 昆明 650011）

復(fù)方臭靈丹合劑是昆明市中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，處方由主產(chǎn)于我國(guó)云南省的臭靈丹草配伍西青果、魚腥草、滇柴胡、桔梗組成，具有清熱疏風(fēng)、解毒利咽、止咳祛痰的功效[1]，主要治療病毒性肺炎、咽炎、支氣管炎等[2-4]。

復(fù)方臭靈丹合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)》[1]，標(biāo)準(zhǔn)中除制劑通則檢查項(xiàng)目外僅收載了方中一味藥的薄層鑒別，質(zhì)量評(píng)價(jià)手段單一，標(biāo)準(zhǔn)亟待完善。目前，關(guān)于復(fù)方臭靈丹合劑的質(zhì)量研究報(bào)道較少[5-6]，為了表征該制劑中各種組分的群體特征，本研究采用HPLC 法建立復(fù)方臭靈丹合劑的特征圖譜，同時(shí)測(cè)定該制劑中7 個(gè)指標(biāo)成分的含量，為完善該制劑的質(zhì)量表征方法提供參考，為其后續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（全自動(dòng)進(jìn)樣器，2998 型DAD 檢測(cè)器，Empower 液相色譜工作站，美國(guó)Waters 公司）；PT-124/85S 型分析天平（十萬(wàn)分之一，華志電子科技有限公司）。

1.2 材料

15 批復(fù)方臭靈丹合劑由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供（編號(hào)：S1 ～ S15，批號(hào)分別為：21070801、22070501、21112201、21101001、20110901、21082701、21122101、22040501、21100801、21111801、21101001、22010201、22051001、22040301、22031501，規(guī)格：250 mL/瓶）。沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201906，純度：91.5%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707，純度：90.5%）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201809，純度：94.9%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201610，純度：99.1%）、洋艾素對(duì)照品（批號(hào)：111879-201102，純度：97.2%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。異綠原酸C 對(duì)照品（批號(hào)：20120302，純度≥98%）、異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)：J30GB154008，純度≥98%）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：M12GB148216，純度：98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：J2126628，純度≥98%）、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：J1825078，純度≥90%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：K2452C186，純度≥98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。乙腈（美國(guó)TEDIA公司）、甲醇（美國(guó)TEDIA 公司）、磷酸（批號(hào)：H2020219，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），以上試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xselect HSS T3柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 5 min，4%→8%A；5 ～ 10 min，8%→10%A；10 ～ 20 min，10%→15%A；20 ～ 40 min，15%→19%A；40 ～ 55 min，19%→32%A；55 ～ 65 min，32%→40%A；65 ～80 min，40%→52%A；80 ～ 88 min，52%→55%A；88 ～ 90 min，55%→4%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為0 ～ 10 min，270 nm；10 ～ 90 min，350 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取沒(méi)食子酸、綠原酸、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、洋艾素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為51.90 μg/mL、61.90 μg/mL、10.40 μg/mL、52.90 μg/mL、28.35 μg/mL、5.95 μg/mL、102.10 μg/mL、74.75 μg/mL、47.90 μg/mL、4.20 μg/mL、2.55 μg/mL、40.80 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取復(fù)方臭靈丹合劑25 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲30 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。用50%甲醇10 mL 洗滌量瓶及濾渣，合并濾液及洗滌液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)：S8），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 值分別小于0.31%和2.55%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)：S8），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，以綠原酸為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 分別小于0.52%和2.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)：S8），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，以綠原酸為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 值分別小于0.72%和2.80%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 特征圖譜的建立 取15 批復(fù)方臭靈丹合劑，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備15 批供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以S1 號(hào)樣品色譜圖為參照，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為0.5，經(jīng)多點(diǎn)校正峰匹配，得到15 批復(fù)方臭靈丹合劑的特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.994、0.959、0.990、0.995、0.946、0.998、0.959、0.987、0.996、0.994、0.999、0.989、0.999、0.970、0.998，相似度均大于0.940，表明不同批次復(fù)方臭靈丹合劑的化學(xué)成分相似性良好。15 批復(fù)方臭靈丹合劑特征圖譜疊加圖譜見(jiàn)圖1。通過(guò)比較分析15 批樣品的特征圖譜，共標(biāo)定了21 個(gè)特征峰，通過(guò)與對(duì)照品色譜峰進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)了其中12 個(gè)特征峰，1 號(hào)峰為沒(méi)食子酸、4 號(hào)峰為綠原酸、6 號(hào)峰為牡荊素、7 號(hào)峰為蘆丁、8 號(hào)峰為金絲桃苷、9 號(hào)峰為槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷，12 號(hào)峰為槲皮苷、13 號(hào)峰為異綠原酸C，14 號(hào)峰為槲皮素，16 號(hào)峰為山柰酚，17號(hào)峰為異鼠李素、21 號(hào)峰為洋艾素，選擇分離度較好、峰面積較大的4 號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1?；旌蠈?duì)照品溶液及復(fù)方臭靈丹合劑供試液的特征圖譜見(jiàn)圖2。復(fù)方臭靈丹合劑特征圖譜中有21個(gè)特征峰，其中12個(gè)峰（峰1、4、6、7、8、9、12、13、14、16、17、21） 分別與相應(yīng)的參照物保留時(shí)間相同。以綠原酸參照物峰相應(yīng)的峰為S 峰，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值為0.413（峰2）、0.716（峰3）、1.066（峰5）、2.339（峰10）、2.445（峰11）、3.380（峰15）、4.093（峰18）、4.303（峰19）、4.325（峰20）。

圖1 15 批復(fù)方臭靈丹合劑HPLC 特征圖譜疊加圖（S1 ～ S15）Fig.1 Characteristic chromatogram of 15 batches of Compound Choulingdan Mixture (S1 ～ S15)

圖2 混合對(duì)照品溶液（A）和復(fù)方臭靈丹合劑供試液（B）HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standard solution (A) and Compound Choulingdan Mixture (B)

表1 特征峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.1 Relative retention time of characteristic peaks

2.1.6 共有峰歸屬 按照復(fù)方臭靈丹合劑的制法分別制得臭靈丹草、魚腥草、滇柴胡、桔梗、西青果單味飲片水煎液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備各單味藥樣品供試液，進(jìn)樣測(cè)定獲得圖譜，見(jiàn)圖3。以各色譜峰的保留時(shí)間、紫外吸收光譜圖為鑒別依據(jù)，結(jié)果表明，10、15、18、21 號(hào)色譜峰為臭靈丹草特征峰；16、17、19、20 號(hào)色譜峰為滇柴胡特征峰；1 號(hào)色譜峰為西青果特征峰；2 號(hào)色譜峰為桔梗特征峰；3 號(hào)色譜峰為臭靈丹草、西青果、魚腥草、滇柴胡所共有；4、5 號(hào)色譜峰為臭靈丹草、魚腥草、滇柴胡所共有；6、8 號(hào)色譜峰為臭靈丹草、魚腥草所共有；7、9 號(hào)色譜峰為臭靈丹草、滇柴胡、魚腥草所共有；11、13 號(hào)色譜峰為臭靈丹草、滇柴胡所共有；12、14號(hào)峰為魚腥草、滇柴胡所共有。

圖3 復(fù)方臭靈丹合劑各單味藥供試液HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of single herb sample solution of Compound Choulingdan Mixture

2.1.7 聚類分析（CA） 采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析軟件對(duì)21 個(gè)特征峰的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-Score 標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用組間連接聚類方法對(duì)15個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示當(dāng)平方歐氏距離為15 時(shí)，可將15 批復(fù)方臭靈丹合劑聚為2類，樣品S4 ～ S6、S2、S9、S11、S15 聚為一類，樣品S1、S3、S7、S8、S10、S12 ～ S14 聚為一類。這表明復(fù)方臭靈丹合劑樣品存在批次間質(zhì)量差異。

圖4 15 批復(fù)方臭靈丹合劑的聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram of 15 batches of Compound Choulingdan Mixture

2.2 多指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 與“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件一致。

2.2.2 供試品溶液制備 與“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法一致。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 取沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為103.80 μg/mL、123.80 μg/mL、105.80 μg/mL、204.20 μg/mL、149.50 μg/mL、95.80 μg/mL、81.60 μg/mL 的 混 合對(duì)照品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察 （1） 線性關(guān)系考察 吸取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，7 種成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 復(fù)方臭靈丹合劑7 個(gè)成分的線性關(guān)系考察Tab.2 Linear relationship of 7 ingredients of Compound Choulingdan Mixture

（2）精密度試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)S8），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素峰面積的RSD 值分別為1.20%、1.13%、1.23%、1.17%、1.90%、0.66%、1.26%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)：S8）供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6 份樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素峰面積的RSD值分別為2.63%、2.77%、2.90%、2.79%、2.58%、1.85%、1.36%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方臭靈丹合劑（編號(hào)：S8），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素峰面積的RSD 值分別為2.94%、2.21%、3.07%、1.83%、0.62%、1.90%、3.11%，結(jié)果表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知成分含量的復(fù)方臭靈丹合劑12.5 mL，共6 份，分別按照樣品中成分含量的100%加入各對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素色譜峰的峰面積，并計(jì)算其平均加樣回收率分別為97.87%、98.71%、97.69%、101.38%、100.33%、100.13%、99.64%，RSD 分別為0.91%、1.03%、1.94%、1.23%、1.76%、1.46%、1.44%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 多指標(biāo)成分含量測(cè)定 取15 批復(fù)方臭靈丹合劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算7 個(gè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。15 批復(fù)方臭靈丹合劑中沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、異綠原酸C、槲皮素、洋艾素的含量分 別 為3.91 ～ 15.60 μg/mL、4.72 ～ 12.64 μg/mL、3.72 ～12.56 μg/mL、7.21 ～ 19.14 μg/mL、2.36 ～ 5.77 μg/mL、0.86 ～ 3.18 μg/mL、2.71 ～ 7.32μg/mL。

表3 15 批復(fù)方臭靈丹合劑中7 個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果(μg/mL, n = 2)Tab.3 The results of the determination of 7 ingredients in 15 batches of the compound Choulingdan Mixture (μg/mL, n = 2)

2.2.6 主成分分析（PCA） 采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析軟件對(duì)7 個(gè)成分的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-Score 標(biāo)準(zhǔn)化處理，KOM 檢驗(yàn)法和Bartlett 球體檢驗(yàn)法的結(jié)果顯示KOM 值為0.631，Bartlett 球體檢驗(yàn)的Sig 值＜0.05，表明數(shù)據(jù)存在一定的相關(guān)性，支持主成分分析。以特征值≥1 作為提取標(biāo)準(zhǔn)，共得到2 個(gè)主成分，第1 主成分特征值為4.816，方差貢獻(xiàn)率為68.800%，第2 主成分的特征值為1.214，方差貢獻(xiàn)率為17.347%，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了86.147%，能夠代表樣品的大部分信息。成分矩陣能反映變量與主成分的相關(guān)程度，載荷系數(shù)的絕對(duì)值越大，越接近于1，主成分與該變量相關(guān)程度越高，該變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)度也越大[7]。由表4 可知，主成分1 主要反映了槲皮苷、槲皮素、綠原酸、沒(méi)食子酸、蘆丁、異綠原酸C 成分含量的信息，對(duì)主成分2 貢獻(xiàn)較大的是洋艾素成分含量的信息，2 個(gè)主成分包含化學(xué)成分的所有信息，表明復(fù)方臭靈丹合劑的質(zhì)量影響因素是多成分相互作用的。根據(jù)載荷矩陣計(jì)算主成分得分和以各個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率占兩個(gè)主成分總方查貢獻(xiàn)率為權(quán)重計(jì)算的綜合得分。結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)綜合得分可知，S1、S3、S7、S8、S10、S12 ～ S14樣品的綜合得分為正數(shù)，其余批次的樣品得分為負(fù)數(shù)，這與聚類分析和含量測(cè)定結(jié)果相符。將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件，繪制主成分分析得分散點(diǎn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。從結(jié)果可知15 批復(fù)方臭靈丹合劑可被分為2 類，對(duì)應(yīng)的批次與特征圖譜聚類分析結(jié)果一致。

圖5 主成分得分散點(diǎn)圖Fig.5 Scatterplot of principal component score

表4 初始因子荷載矩陣Tab.4 Component matrix

表5 主成分得分及綜合評(píng)分Tab.5 Rank of principal component scores and comprehensive scores

2.2.7 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

為了更客觀地反映各批次制劑質(zhì)量的差異性，在主成分分析的基礎(chǔ)上，將15 批復(fù)方臭靈丹合劑的7個(gè)成分含量的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA-P14.1 軟件中，進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA 分析。得到的模型擬合參數(shù)R2Xcum= 0.821，R2Ycum= 0.826，Q2cum= 0.684，表明建立的數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定且預(yù)測(cè)能力較好[8]。OPLS-DA 的得分見(jiàn)圖6，結(jié)果表明樣品被分2 類，與PCA 結(jié)果一致。為防止模型出現(xiàn)過(guò)擬合，對(duì)模型進(jìn)行200 次置換檢驗(yàn)驗(yàn)證，置換檢驗(yàn)參數(shù)的R2、Q2的截距分別為0.109、-0.566，結(jié)果見(jiàn)圖7。最右端的R2和Q2均大于左端隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2和Q2，表明建立的模型中不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。變量重要性投影值（VIP）是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP 的大小與變量差異的影響程度成正比[9]。以VIP ＞1 為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選出5 個(gè)貢獻(xiàn)度較大的變量，結(jié)果見(jiàn)圖8，依次為槲皮苷、槲皮素、異綠原酸C、綠原酸、沒(méi)食子酸，表明這5 個(gè)成分是引起制劑質(zhì)量差異的主要成分。

圖6 OPLS-DA 得分圖Fig.6 OPLS-DA score plot

圖7 OPLS-DA 模型置換檢驗(yàn)圖Fig.7 OPLS-DA permutation test

圖8 VIP 值圖Fig.8 VIP value

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰響應(yīng)值較大且峰形較好?？疾炝薟aters Xselect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5μm）、Hanbon Hedera ODS-1（4.6 mm×250 mm，5μm）、Waters XTerra C18（4.6 mm×250 mm，5μm）三種色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同色譜柱對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑中的槲皮苷、沒(méi)食子酸色譜峰的分離度影響較大，最終確定選擇Waters Xselect HSS T3 色譜柱。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，在350 nm 波長(zhǎng)下各成分響應(yīng)較好，色譜峰信息較為豐富，在270 nm 下，沒(méi)食子酸紫外吸收較強(qiáng)，為了使多指標(biāo)成分能在同一張色譜圖中顯現(xiàn)，采用了分段變波長(zhǎng)法檢測(cè)。

3.2 特征圖譜分析

特征圖譜標(biāo)定的21 個(gè)特征峰中，西青果和桔梗的特征峰信息較少。西青果單味藥供試液進(jìn)樣后雖然在270 nm 色譜峰比350 nm 多，但歸屬于西青果的特征峰很少，兼顧其他藥味的整體評(píng)價(jià)，在10 ～ 90 min選擇了350 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。全波長(zhǎng)掃描下發(fā)現(xiàn)桔梗單味藥在不同波長(zhǎng)下的特征峰信息都較少，這與桔梗中的桔梗皂苷D 等皂苷類成分通常無(wú)紫外吸收或處于末端吸收響應(yīng)值低有關(guān)，后期可采用諸如紅外光譜檢測(cè)技術(shù)[10-11]、蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)[12]等進(jìn)一步完善這兩味藥的信息表征。

3.3 含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇

臭靈丹草味辛、性寒，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效，為方中君藥，含有臭靈丹酸、臭靈丹二醇等桉烷型倍半萜成分，洋艾素、金腰乙素等黃酮類成分以及揮發(fā)油、氨基酸等其他成分[13]。洋艾素在2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中作為臭靈丹草含量測(cè)定項(xiàng)下的指標(biāo)成分，具有抑菌抗氧化等藥理作用[14-15]。沒(méi)食子酸、綠原酸、異綠原酸C 等酚酸類成分具有抗菌、抗炎、抗病毒等藥理作用[16-19]，蘆丁、槲皮苷、槲皮素等黃酮類成分具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抑菌活性[20-21]，這些成分均有抑菌抗炎的藥理活性，且在圖譜中含量相對(duì)較高，是復(fù)方臭靈合劑治療上呼吸道感染的活性成分，因此本研究測(cè)定了上述7 個(gè)指標(biāo)性成分的含量。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

PCA 和OPLS-DA 將15 批復(fù)方臭靈丹合劑分為兩類，與特征圖譜聚類分析結(jié)果一致。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)S4 ～ S6、S2、S9、S11、S15 批次中的槲皮苷、槲皮素、綠原酸等指標(biāo)性成分含量低于其他批次。通過(guò)OPLS-DA 篩選出的5 個(gè)化學(xué)質(zhì)量差異標(biāo)志物歸屬于處方中的臭靈丹草、魚腥草、滇柴胡、西青果藥味，表明不同批次復(fù)方臭靈丹合劑含量差異可能是由飲片質(zhì)量差異導(dǎo)致。這提示了企業(yè)在制劑生產(chǎn)過(guò)程中需規(guī)范藥材產(chǎn)地與采收加工方法、完善飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并選用優(yōu)質(zhì)飲片投料生產(chǎn)，從而保障復(fù)方臭靈丹合劑的質(zhì)量和臨床療效。

4 結(jié)論

本研究建立了15 批復(fù)方臭靈丹合劑的HPLC 特征圖譜和7 種活性成分含量測(cè)定方法，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)模型分析篩選出槲皮苷、槲皮素、異綠原酸C、綠原酸、沒(méi)食子酸等5 個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物，為該制劑的深入研究與質(zhì)量提升提供了依據(jù)。桔梗中的主要活性成分為三萜皂苷類，在本研究中紫外檢測(cè)條件下無(wú)法有效表征其特征信息，后續(xù)將采用適宜的方法如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等對(duì)其質(zhì)量進(jìn)一步分析，從而更為全面地對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑進(jìn)行質(zhì)量控制。