黃 哲，楊 燁，王世清，黨友超，王 錦

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.浙江圣兆藥物科技股份有限公司分析中心，浙江 杭州 310051）

金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii(Wall）Lingl.的干燥全草[1]，其性平、味甘，具有清熱解毒、生津養(yǎng)顏、祛風(fēng)利濕、鎮(zhèn)驚平肝、扶正固本、潤肺止咳等功效[2-4]，在抗炎、降血糖等方面有良好的生物活性[5]。近年來，金線蓮的使用較為混亂，在福建、浙江、貴州等地區(qū)常將同科植物銀線蓮Goodyera hachijoensisYatabe、斑葉蘭Goodyera schlechtendalianaRchb.f.的干燥全草混做金線蓮藥用，由于性狀相似，并且化學(xué)組分復(fù)雜，現(xiàn)有的形態(tài)鑒別[6-8]等方法難以對金線蓮的品種及質(zhì)量進行較為完整的評價。ITS2 是植物物種鑒定的核心條形碼，也是系統(tǒng)發(fā)育分析最常用的基因之一，在藥用植物鑒定和保護、入侵物種的防治等領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的作用[9-10]。目前，金線蓮在分子鑒定方面的研究主要是利用分子標(biāo)記技術(shù)進行種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析[11-16]，以ITS2 為主的品種鑒定研究鮮見報道。因此，本研究以ITS2 序列為模版，對所收集的開唇蘭屬植物西南齒唇蘭Anoectochilus elwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl.、興仁金線蘭Anoectochilus xingrenensisZ.H.Tsi & X.H.Jin、斑葉蘭屬植物斑葉蘭Goodyera schlechtendalianaRchb.f.等5種植物樣品進行ITS2 序列擴增及測序，同時在NCBI下載臺灣金線蓮Anoectochilus formosanus Hayata、小斑葉蘭Goodyera repens(L.)R.Br.等6 種相關(guān)ITS2 序列，對所得序列采用種內(nèi)種間遺傳距離、聚類分析及ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)進行分析與鑒定，以期能有效區(qū)分黔產(chǎn)金線蓮及其常見易混品。

1 材料

1.1 儀器與試劑

3730XL 型測序儀（美國安捷倫科技公司）；Legend Micro17 型離心機、2720 thermal cycler 型PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）；JY300C 型電泳儀、JYDF(定制)型電泳槽、JY04S-3C 型凝膠成像儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；DFD-700 型水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；L550 型板式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；引物（批號：ESO5222591）購于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；2x TSINGKE Master Mix（批號：TSE003）、TSINGKE高純度低電滲瓊脂糖（批號：TSJ001）、DNA 凝膠回收試劑盒（批號：TSP602-200）、DL2000 Marker（批號：TSJ011-100）購于北京擎科生物科技有限公司。

1.2 樣品

藥材樣本來源于市售及野外采集或NCBI 下載，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)王世清教授鑒定為蘭科植物花葉開唇蘭（金線蓮）Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.、 西 南 齒 唇 蘭Anoectochilus elwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl、 興 仁 金 線 蘭Anoectochilus xingrenensisZ.H.Tsi & X.H.Jin、斑葉蘭屬植物斑葉蘭Goodyera procera(Ker-Gawl.) Hook.和白網(wǎng)脈斑葉蘭（銀線蓮）Goodyera hachijoensisYatabe 的全草。標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥實驗室，藥材信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

2 方法

2.1 DNA 的提取

取藥材適量，用75%乙醇進行表面消毒后，用刀片刮取內(nèi)部藥材約20 mg，加液氮冷凍，用球磨儀加入一粒小鋼珠研磨40 s(50 Hz/s)后，按DP336 試劑盒提取，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR 的擴增及測序

擴增、測序引物一致，引物ITS2-2F：5'-ATGC GATACTTGGTGTGAAT-3'； 反 向 引 物ITS2-2R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR 擴增體系為25 μL，體系包括：正向引物和反向引物各2 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O 水至25 μL。擴增程序：98 ℃，變性3 min；98 ℃，變性10 s；53 ℃退火15 s；72 ℃延伸10 s；35 個循環(huán)。72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由成都擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

測序所得的峰圖采用Codon Code Aligner V5.0軟件(Codon CodeCo，USA) 對序列峰圖進行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，獲得ITS2 序列。利用MEGAX6.4 計算物種種內(nèi)和種間Kimura2-parameter(K2P) 遺 傳 距 離， 構(gòu) 建 鄰 建(Neighborjoining，NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap(BS)(1 000 次重復(fù))檢驗各分支的支持率。采用軟件The ITS2 Database 獲得ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 金線蓮及其常見易混品植物ITS2 序列分析

利用MEGAX6.4 軟件對納入的金線蓮及其常見易混品植物ITS2 序列進行變異分析，得到各品種植物的ITS2 序列長度在325 ～ 329 bp，GC 含量平均值在51.27% ～ 53.58%。各種間的變異位點為71 個，保守位點為261 個，簡約信息位點為52 個，見表2。

表2 ITS2 序列信息表Tab.2 ITS2 sequence information table

各品種的序列種間K2P 遺傳距離分布于0.005 0 ～0.109 9，平均遺傳距離為0.065 0，而種內(nèi)K2P 遺傳距離分布與0 ～ 0.001 8。金線蓮與各品種間的遺傳距離差異較大。其中，金線蓮和臺灣金線蓮種間差異最小，遺傳距離為0.005 0，最大的是銀線蓮，遺傳距離為0.109 9。各個種的種內(nèi)和種間遺傳距離詳情見表3。

表3 種內(nèi)和種間遺傳距離Tab.3 Intraspecific and interspecific genetic distance table

3.3 金線蓮及其常見易混品植物NJ 進化樹鑒定

基于ITS2 序列構(gòu)建金線蓮及其常見易混品植物間的NJ 系統(tǒng)聚類樹，見圖1。從聚類樹上可以看出，各植物按照每個物種的ITS2 序列均單獨聚為一支，Bootstrap1 000 次重復(fù)，各分支支持率較高，金線蓮Bootstrap1 000 支持率達到94%，呈現(xiàn)出良好的單系性。

圖1 NJ 系統(tǒng)聚類樹Fig.1 NJ system clustering tree

3.4 金線蓮及其常見易混品植物ITS2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過The ITS2 database 在線預(yù)測金線蓮及其常見易混品植物的二級結(jié)構(gòu)，見圖2?？梢钥闯鼋鹁€蓮及其常見易混品植物的二級結(jié)構(gòu)符合被子植物一環(huán)（主環(huán)）四臂（4 個螺旋區(qū)）的特征[13]。除興仁金線蘭、麗蕾金線蓮與臺灣金線蓮?fù)?，金線蓮與其它品種的二級結(jié)構(gòu)存在明顯差異，具體表現(xiàn)在四個臂長短不同，莖環(huán)數(shù)目大小也有差異。其中，興仁金線蘭、麗蕾金線蓮、臺灣金線蓮和金線蓮包含13 個內(nèi)環(huán)，4 個發(fā)夾環(huán)；銀線蓮包含9 個內(nèi)環(huán)，4 個發(fā)夾環(huán)，主莖環(huán)多出數(shù)目不等的非閉合小莖環(huán)；斑葉蘭包含11 個內(nèi)環(huán)，4 個發(fā)夾環(huán)，其中，I 臂上的發(fā)夾環(huán)明顯大于其它種，主莖環(huán)多出數(shù)目不等的非閉合小莖環(huán)；西南齒唇蘭、高雄金線蓮、小斑葉蘭包含11 個內(nèi)環(huán)，4 個發(fā)夾環(huán)，但環(huán)的大小、角度和位置上有一定的區(qū)別。綜上所述，ITS2 二級結(jié)構(gòu)特點可作為區(qū)分各品種間的輔助指標(biāo)之一，可為準(zhǔn)確、有效地鑒別中藥材金線蓮及其常見易混品物種提供重要參考。

4 討論

本文利用目前被廣泛認可的DNA 條形碼ITS2 序列片段對金線蓮及其常見易混品植物進行鑒別，金線蓮的ITS2 的序列長度在329 bp，種內(nèi)距離為0.001 8。從遺傳距離上看金線蓮與臺灣金線蓮、高雄金線蓮、麗蕾金線蓮之間的種間遺傳距離較小，表明四者間的親緣關(guān)系較近。而金線蓮與興仁金線蘭、西南齒唇蘭、銀線蓮、斑葉蘭、小斑葉蘭的最小種間距離為0.038 8，最大種間距離為0.109 9，表明金線蓮的種內(nèi)平均K2P 遺傳距離遠小于種間遺傳距離，并已達到序列差異的標(biāo)準(zhǔn)閾值(即種間遺傳距離超過種內(nèi)遺傳距離的十倍，兩者存在明顯的間隙)，種內(nèi)和種間存在一個明顯的“Barcoding Gap”區(qū)域[17]。此外，由構(gòu)建的鄰接樹可以看出，金線蓮單獨聚成一支，并與其他品種植物明顯區(qū)分開。

5 結(jié)論

本研究采用DNA 條形碼分子鑒定對金線蓮及其常見易混品共8 種植物進行品種綜合鑒定研究，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，能有效區(qū)分金線蓮及其常見易混品植物，為后期探索黔產(chǎn)金線蓮的鑒定特征以及金線蓮的開發(fā)和保障臨床安全用藥提供參考。后續(xù)研究應(yīng)以ITS2 及其二級結(jié)構(gòu)作為鑒別依據(jù)對金線蓮及同科同屬植物進行考察和篩選，進而為金線蓮的持續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。