金璟, 何路路, 陳園, 張麗, 劉國成

廣東省婦幼保健院產(chǎn)科(廣東廣州 511400)

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特發(fā)性疾病之一,全球的發(fā)病率為2%～8%[1],其嚴(yán)重威脅母親和嬰兒的健康,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[2]。其病因及發(fā)病機制目前尚未被闡明,目前,普遍認(rèn)為與滋養(yǎng)細(xì)胞分化障礙、異常血管重鑄、母胎免疫平衡失調(diào)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、遺傳與環(huán)境交互作用等有關(guān)[3]。近年來,胎盤源性學(xué)說認(rèn)為其發(fā)病與胎盤不良發(fā)生發(fā)育有關(guān),本研究旨在利用高通量測序技術(shù)對正常妊娠和PE患者胎盤組織進(jìn)行測序,構(gòu)建PE 相關(guān)的mRNA差異表達(dá)譜。隨后用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)mRNA,揭示差異mRNA可能的功能和主要參與的信號傳導(dǎo)途徑及代謝途徑。試圖更全面地尋找與PE發(fā)生相關(guān)的新的基因,篩選特定基因作為PE的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點以進(jìn)行早期預(yù)測和臨床精細(xì)化管理。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2019年12月在廣東省婦幼保健院剖宮產(chǎn)分娩孕產(chǎn)婦共49例。其中足月正常妊娠孕產(chǎn)婦23例作為對照組,診斷為PE孕產(chǎn)婦26例作為觀察組。采集樣本中選擇對照組3例(CK),觀察組6例(T)[其中早發(fā)型PE 3例(T1),晚發(fā)型PE 3例(T2)],共9例送往廣州基迪奧生物科技公司,以協(xié)助高通量測序。利用實時熒光定量PCR,選擇對照組中剩余的20例及觀察組中剩余的20例,驗證差異表達(dá)基因。研究對象入組標(biāo)準(zhǔn):選擇的孕婦為單胎自然妊娠,入組觀察組的孕婦符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)(參見《妊娠期高血壓疾病:ISSHP分類、診斷和管理指南(2018)》)。排除標(biāo)準(zhǔn):排除妊娠期合并癥,如妊娠期糖尿病、肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)、原發(fā)性高血壓、腎炎、心臟病、肝炎以及其他內(nèi)外科妊娠合并癥;排除妊娠期和(或)分娩期并發(fā)癥,如前置胎盤、胎盤早剝、胎兒窘迫、羊水過多、羊水過少、巨大兒、胎兒生長受限、胎兒先天性疾病等。所有研究對象知情同意并簽屬知情同意書。

研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過(廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202101205]號)

1.2 研究方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建 正常物種中,90%以上的RNA為rRNA,因此需要在提取樣本的總RNA后,通過常規(guī)試劑盒去除rRNA,將mRNA富集。進(jìn)一步將富集得到的mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA,修復(fù)cDNA雙端后,加上接頭和PCR擴(kuò)增,構(gòu)建上機文庫。

1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控 為保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量,信息分析之前,對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,以減少無效數(shù)據(jù)的分析的干擾。過濾數(shù)據(jù)后,分析堿基的組成及質(zhì)量分布,以直觀展示數(shù)據(jù)質(zhì)量情況。堿基組成越平衡,質(zhì)量越高,后續(xù)分析則越準(zhǔn)確。

1.2.3 序列比對分析 (1)核糖體比對:使用短 reads 比對工具 bowtie2將clean reads 與該物種的核糖體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。在正常匹配情況下,把比對上核糖體的 reads刪除,將保留下來的unmapped reads用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。(2)參考比對:使用HISAT2軟件進(jìn)行比對分析,該項目選擇比對的是參考基因組。HISAT2采用的策略是層級比對,最大限度地保證reads的比對率以及準(zhǔn)確性。(3)比對區(qū)域統(tǒng)計:根據(jù)全部定位到基因組的reads結(jié)果,計算reads在參考基因組中的分布。將參考基因組比對到的區(qū)域劃分為外顯子,內(nèi)含子和基因間區(qū)域。

1.2.4 基因表達(dá)量統(tǒng)計 (1)校正測序的深度;(2)校正基因或轉(zhuǎn)錄本的長度;(3)得到基因的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值,然后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5 樣本關(guān)系分析 基于各樣本表達(dá)量結(jié)果,通過PCA分析和計算樣本間Pearson相關(guān)系數(shù),了解樣本之間的重復(fù)性情況。

1.2.6 組間差異分析 用DESeq2軟件分析時所輸入的數(shù)據(jù)是在基因表達(dá)水平分析中得到的reads count數(shù)據(jù)。分析主要分為三個部分:(1)將read count標(biāo)準(zhǔn)化;(2)計算假設(shè)檢驗概率(P值);(3)對多重假設(shè)檢驗進(jìn)行校正,得到FDR值。根據(jù)差異分析結(jié)果,顯著性差異表達(dá)基因的篩選條件是:FDR<0.05且|log2FC|>1。根據(jù)各比較組的顯著性差異基因。

1.2.7 qRT-PCR驗證差異表達(dá)基因 結(jié)合上述富集分析,篩選出差異表達(dá)基因。擴(kuò)大樣本量,選擇足月正常妊娠和子癇前期胎盤組織樣本各20例,進(jìn)行qRT-PCR檢測上述基因的表達(dá),驗證其與高通量測序結(jié)果是否一致。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕產(chǎn)婦一般臨床資料比較 觀察組平均最大收縮壓、最大舒張壓大于對照組(P<0.05), 觀察組分娩孕周、新生兒體重、新生兒出生時的身長小于對照組(P<0.05),觀察組和對照組孕產(chǎn)婦的年齡、體重、體質(zhì)指數(shù)及早產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控 信息分析之前,進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過濾,以減少無效數(shù)據(jù)帶來的分析干擾。表2顯示的是原始數(shù)據(jù)過濾后,得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量情況。Clean Data(%)是數(shù)據(jù)過濾后得到的高質(zhì)量reads數(shù)目及占原始下機的reads數(shù)目的百分比;Clean Data(bp)是數(shù)據(jù)過濾后得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)堿基總數(shù);AF(After filter)是原始數(shù)據(jù)過濾后樣本堿基信息。表中Clean Data(%)>99%,過濾后的數(shù)據(jù)Q30(錯誤率<0.1%)>90%,說明測序數(shù)據(jù)可信。

表2 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計表

2.3 比對參考基因組分析 以參考基因組為模板,將原始數(shù)據(jù)過濾后得到的Clean Data與其比對,得出每個樣本測序的數(shù)據(jù),比對率,基因組在三個區(qū)域的比對情況,用于后續(xù)基因表達(dá)量的計算。如表3所示,Total是核糖體過濾后得到的有效reads數(shù)量;Unique Mapped(%)是在參考基因組上唯一比對的 reads 數(shù)及占Total的比例;Multiple Mapped(%)是在參考基因組上多處比對的 reads 數(shù)及占Total的比例;Total Mapped(%)是在參考基因組比對上的reads的總數(shù)及占Total的比例。比對結(jié)果顯示,所有測序樣本的Total Mapped>96%,說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)控良好。

表3 基于參考基因組的比對分析統(tǒng)計情況

2.4 基因表達(dá)量的統(tǒng)計 通過比較Clean Data和參考基因組,用FPKM公式計算基因表達(dá)量,根據(jù)正常妊娠和PE胎盤組織樣本基因表達(dá)情況繪制基因表達(dá)量小提琴圖(圖1)。

圖1 基因表達(dá)量小提琴圖

2.5 差異表達(dá)基因分析 基因表達(dá)量統(tǒng)計完成后,使用DESeq2軟件分析差異表達(dá)基因,比較正常妊娠組(CK)和PE組(T)以及早發(fā)型PE組(T1)和晚發(fā)型PE組(T2)差異基因表達(dá)情況。結(jié)合差異分析結(jié)果,顯著差異表達(dá)基因的篩選條件為:FDR<0.05 且 |log2FC|>1。結(jié)果顯示,正常妊娠組和PE組相比,有12個基因表達(dá)上調(diào),39個基因表達(dá)下調(diào);早發(fā)型PE組和晚發(fā)型PE組相比,有15個基因表達(dá)上調(diào),17個基因表達(dá)下調(diào)。見表4。

表4 差異表達(dá)基因分析結(jié)果統(tǒng)計表

2.5.1 PE胎盤組織顯著差異上調(diào)表達(dá)基因 PE胎盤組織基因的差異表達(dá)與其病理的發(fā)生、發(fā)展密不可分,找出正常妊娠和PE胎盤組織顯著差異表達(dá)的基因,有助于我們明確病理情況下異常基因的調(diào)控模式,在細(xì)胞分子水平深入研究PE的發(fā)病機制。根據(jù)差異表達(dá)基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出前十個顯著差異上調(diào)表達(dá)基因(表5)。

表5 PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達(dá)基因

2.5.2 PE胎盤組織顯著差異下調(diào)表達(dá)基因 顯著差異上調(diào)表達(dá)基因在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用,但同時基因下調(diào)表達(dá)可能使機體抑制疾病發(fā)生的能力降低,導(dǎo)致某些通路的異常激活。因此,根據(jù)差異表達(dá)基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出前十個顯著差異下調(diào)表達(dá)基因(表6)。

表6 PE胎盤組織中前十個顯著差異下調(diào)表達(dá)基因

2.5.3 早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達(dá)基因 根據(jù)孕周將PE分為早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE。早發(fā)型PE往往伴隨著嚴(yán)重的母嬰并發(fā)癥,而晚發(fā)型PE的預(yù)后要比早發(fā)型PE的好。造成這種差異的原因可能是二者的發(fā)病機制不同。因此,可以將PE分為早發(fā)型和晚發(fā)型進(jìn)行分別研究,探討該病的早期診斷標(biāo)志物。因此,根據(jù)差異表達(dá)基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達(dá)基因(表7)。

表7 早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達(dá)基因

2.6 差異表達(dá)基因功能富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 差異表達(dá)基因GO富集分類結(jié)果顯示:(1)差異表達(dá)mRNA參與生物過程主要富集在:GO:0006954 inflammatory response(炎癥反應(yīng));GO:0002376 immune system process(免疫系統(tǒng)過程);GO:0045321 leukocyte activation(白細(xì)胞活化);GO:0042108 positive regulation of cytokine biosynthetic process(細(xì)胞因子生物合成過程的正調(diào)控);GO:0042107 cytokine metabolic process(細(xì)胞因子代謝過程)等GO Term上。(2)差異表達(dá)mRNA作為細(xì)胞組分主要富集在:GO:0005886 plasma membrane(質(zhì)膜);GO:0036019 endolysosome(溶酶體);GO:0005615 extracellular space(細(xì)胞外區(qū)域);GO:0031982 vesicle(囊泡);GO:0009986 cell surface(細(xì)胞表面)等GO Term上。(3)差異表達(dá)mRNA執(zhí)行分子功能主要富集在:GO:0050840 extracellular matrix binding(細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合);GO:0005344 oxygen transporter activity(氧轉(zhuǎn)運蛋白活性);GO:0004872 receptor activity(受體活性);GO:0038021 leptin receptor activity(瘦素受體活性);GO:0004915 interleukin-6 receptor activity(白細(xì)胞介素6受體活性)等GO Term上。

2.6.2 KEGG信號通路富集分析 KEGG中富集了前20條信號通路,Toll樣受體信號通路、Notch信號通路、HIF-1信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路均與PE的發(fā)病有著顯著相關(guān)性,從這些方面進(jìn)一步研究其發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點,可能有助于PE的早期診斷和治療。

2.6.3 DO功能富集分析 疾病相似性研究對了解PE發(fā)病機制、早期預(yù)防、診斷及新藥的研究和開發(fā)具有重要意義。因此,分析差異表達(dá)基因的疾病本體論(disease ontology,DO)富集具有重要的生物學(xué)意義。結(jié)果顯示,免疫系統(tǒng)疾病、血管功能障礙、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等可能與PE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.7 qRT-PCR結(jié)果 與對照組相比,觀察組孕婦胎盤組織中ENG和TREM1基因表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);APLN和RGS5基因表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表8。

表8 qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-Seq測序結(jié)果比較

3 討論

PE是一種常見且復(fù)雜的妊娠疾病,其發(fā)病學(xué)說多樣,既往研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制涉及母胎免疫平衡失調(diào)、氧化應(yīng)激、代謝紊亂、遺傳與環(huán)境交互作用等,其中涉及到多個致病基因的異常表達(dá)[3]。

胎盤是人類妊娠的重要器官,其發(fā)育和功能的失常與多種病理妊娠有關(guān)。人胎盤是由滋養(yǎng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等組成的復(fù)雜器官,每一種細(xì)胞都在妊娠期間發(fā)揮著不同的關(guān)鍵作用[4]。包括滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤,蛻膜免疫,絨毛血管生成,母體和胎兒的內(nèi)分泌調(diào)節(jié),以及營養(yǎng)物質(zhì)/廢物的運輸?shù)萚5]。因此,胎盤有一個獨特的轉(zhuǎn)錄組,包括許多在其他人體器官中不存在的mRNA。使用高通量測序研究轉(zhuǎn)錄組的方法,已經(jīng)被廣泛用于研究PE、胎兒生長受限、早產(chǎn)等病理過程中胎盤發(fā)育和功能的障礙。全面了解胎盤轉(zhuǎn)錄組在PE病理過程中的變化,對理解PE病因?qū)W的分子機制、開發(fā)新的生物標(biāo)志物或識別治療靶點具有重要意義。

本實驗通過RNA-Seq明確了正常妊娠和PE胎盤組織存在多個基因的差異表達(dá),結(jié)果表明,PE組篩選出51個差異表達(dá)基因,其中包括ENG、TREM1、NLRP10、DHRS2、AREG、ALPG等12個基因上調(diào);APLN、RGS5、ANGPTL1等39個基因下調(diào)。差異表達(dá)基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子代謝等多種生物過程。生物學(xué)通路分析結(jié)果顯示,Toll樣受體信號通路、Notch信號通路、HIF-1信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路與PE的發(fā)病顯著關(guān)聯(lián)。DO分析結(jié)果表明差異基因主要富集的疾病有:免疫系統(tǒng)疾病、血管功能障礙、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等有關(guān)。差異基因富集分析為我們進(jìn)一步了解PE的發(fā)生發(fā)展機制提供了新的依據(jù)。通過對GO、KEGG和DO富集綜合分析,篩選出4個差異表達(dá)基因(ENG、TREM1、APLN和RGS5),采用qRT-PCR驗證上述基因,結(jié)果顯示ENG和TREM1基因在子癇前期胎盤組織中表達(dá)上調(diào),APLN和RGS5基因在子癇前期胎盤組織中表達(dá)下調(diào)。與高通量測序結(jié)果相吻合,說明測序結(jié)果可信,提示這些可能是參與子癇前期疾病發(fā)生發(fā)展的主要基因。

ENG(Endoglin)基因編碼的蛋白是一種同型二聚體跨膜蛋白,作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要糖蛋白,其對調(diào)控血管的生成起重要作用[6]。該蛋白是正常胚胎外血管生成和胚胎心臟發(fā)育所必須的,可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及對血流的反應(yīng),從而促進(jìn)血管重建和血管生成過程中正常血管形態(tài)的建立[6-7]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括蛋白同型二聚活性和糖胺聚糖結(jié)合。其相關(guān)通路包括TGF-β受體信號通路和TGF-β信號通路。Levine等[8]的研究顯示,PE患者血清中sEng水平顯著增加,且這種增加開始于PE發(fā)病前2～3個月。與晚發(fā)型PE相比,早發(fā)型PE循環(huán)中sEng的水平明顯升高。體外動物實驗證實,阻斷Eng的表達(dá)可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和浸潤。因此,我們推測Eng的異常表達(dá)可能會抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的生長和遷移,導(dǎo)致胎盤血管重鑄失敗,從而導(dǎo)致胎盤血流灌注減少,誘發(fā)PE的一系列癥狀。

TREM1基因編碼一種在骨髓細(xì)胞上表達(dá)的免疫球蛋白超家族受體[9]。該蛋白通過刺激促炎性趨化因子和細(xì)胞因子的釋放以及細(xì)胞活化標(biāo)記物的表面表達(dá)增加,從而來增強由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10]。研究證實,TREM1是炎癥反應(yīng)的重要啟動因子,一旦TREM1激活,可以促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的合成,從而放大炎癥反應(yīng)[11]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括支架蛋白結(jié)合;其相關(guān)通路包括Toll樣受體信號通路和血管壁的細(xì)胞表面相互作用。近年來,有學(xué)者對PE患者胎盤組織進(jìn)行微陣列分析,結(jié)果顯示,與正常妊娠孕婦相比,PE患者胎盤組織中的TREM1表達(dá)水平顯著上調(diào)。大量研究顯示,激活TREM1可以誘發(fā)炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如TNF-S、IL-6、GM-CSF等[10-11]。過度激活的炎癥因子可影響滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤和凋亡,也可導(dǎo)致PE患者血管內(nèi)皮損傷。

APLN(Apelin)基因編碼的肽作為G蛋白偶聯(lián)的Apelin受體的內(nèi)源性配體。編碼的前蛋白被蛋白水解加工成具有生物活性的C末端肽片段。這些肽片段激活不同的組織特異性信號通路,調(diào)節(jié)不同的生物功能,包括體液平衡、心血管功能、免疫調(diào)節(jié)和胰島素分泌[12]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括信號受體結(jié)合和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合;其相關(guān)通路包括GPCR和肽配體結(jié)合受體。Apelin在人體內(nèi)廣泛表達(dá),尤其在胎盤組織中顯示高表達(dá),且從早期妊娠到晚期妊娠其在胎盤組織中的表達(dá)呈下降趨勢,提示Apelin可能參與調(diào)控胎盤的形成和胎兒的生長發(fā)育[13]。研究發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤組織中Apelin水平較正常妊娠降低;給妊娠14天的PE模型小鼠每天注射Apelin-13,連續(xù)5 d,發(fā)現(xiàn)孕鼠的血壓明顯下降,尿蛋白定量減少,心功能也有所改善;此外胚胎存活數(shù)和胎盤的重量也增加了[14]?；贏pelin擴(kuò)張血管的生理功能,我們推測胎盤組織中Apelin表達(dá)的減少可能影響滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮螺旋動脈的浸潤,從而導(dǎo)致胎盤循環(huán)阻力增加,誘發(fā)PE。

PE根據(jù)孕周不同分為早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE。早發(fā)型PE常伴有嚴(yán)重的母嬰并發(fā)癥,而晚發(fā)型PE的預(yù)后優(yōu)于早發(fā)型PE。造成這種差異的原因可能是二者的發(fā)病機制不同。因此,可以將PE分為早發(fā)型和晚發(fā)型進(jìn)行分別研究,探討該病的早期診斷標(biāo)志物。我們選取早發(fā)型和晚發(fā)型PE差異表達(dá)的RGS5基因進(jìn)一步討論分析。RGS5基因編碼G蛋白信號(RGS)家族的一個調(diào)節(jié)因子。RGS蛋白是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,通過發(fā)揮GTPase激活子的作用參與異三聚體G蛋白的調(diào)控[15]。該基因是染色體1q上導(dǎo)致血壓升高的三個基因之一,也是缺氧誘導(dǎo)因子-1依賴的缺氧誘導(dǎo)基因,參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[16]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括GTPase激活劑活性;其相關(guān)通路包括GPCR信號通路和肌層松弛和收縮信號通路。既往研究顯示RGS5作為G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在血壓的調(diào)節(jié)和血管的再生中發(fā)揮作用,這與PE的發(fā)病機制有關(guān)。動物實驗表明,敲除RGS5的孕鼠可通過增強血管對AngⅡ的敏感性引起妊娠期高血壓[17]。目前對RGS5的研究主要集中在腫瘤方面,RGS5在PE發(fā)病機制中的作用有待進(jìn)一步探索。

總之,本研究運用RNA-Seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平篩查了正常妊娠和PE胎盤組織的差異表達(dá)基因,并對差異基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析,初步定位出候選關(guān)鍵基因ENG、TREM1、APLN和RGS5,下一步我們將對這些候選基因進(jìn)行動物模型基因表達(dá)驗證,并計劃通過增加樣本量繼續(xù)研究PE胎盤組織基因差異性表達(dá)及調(diào)控機制,以期揭示PE的發(fā)生發(fā)展機制,獲得藥物治療靶點。

利益相關(guān)聲明:作者聲明無任何利益相關(guān)。

作者貢獻(xiàn)說明:金璟醞釀和設(shè)計實驗,實施研究,起草論文;何路路實施研究,采集數(shù)據(jù),分析解釋數(shù)據(jù)及支持性貢獻(xiàn);陳園實施研究,采集數(shù)據(jù),分析解釋數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析及支持性貢獻(xiàn);張麗醞釀和設(shè)計實驗,設(shè)計論文框架結(jié)構(gòu),收集標(biāo)本;劉國成確定論文選題,修改論文,設(shè)計研究方法。