方麗, 牛廣旭, 吳士茜, 王靜

邯鄲市中心醫(yī)院病理科(河北邯鄲 056000)

全球范圍內(nèi),肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)每年死亡例數(shù)達35.81萬人,是全球第五大常見惡性腫瘤和第四大腫瘤相關(guān)死亡原因[1]。隨著HCC早期診斷及介入治療等技術(shù)的發(fā)展,可延長患者的生存時間,但部分患者即使經(jīng)積極治療后,仍會發(fā)生腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移,導致不良預后[2]。深入探究HCC的發(fā)生機制,對于尋找提示HCC患者預后的分子標志物,具有重要意義。細胞周期進程受到細胞周期蛋白(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的嚴格控制,HCC的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期調(diào)節(jié)紊亂關(guān)系密切[3]。因此,檢測癌組織中參與調(diào)節(jié)細胞周期進程的細胞周期相關(guān)蛋白表達情況有助于預測HCC患者的生存預后,指導臨床診治及隨訪。CDK2相關(guān)性Culin結(jié)構(gòu)域1(CDK2-associated cullin1,CAC1)是一個含有Cullin結(jié)構(gòu)域的369個氨基酸的蛋白質(zhì),以依賴細胞周期的方式表達,在G1晚期至S期表達升高。研究發(fā)現(xiàn),CAC1與CDK2相互作用并促進CDK2蛋白的激酶活性,促進腫瘤細胞增殖[4]。細胞周期蛋白B2(CCNB2)、細胞周期蛋白Y(Cyclin Y)、細胞周期蛋白E1(Cyclin E1)均屬于細胞周期蛋白家族成員。CCNB2定位于高爾基體,其與轉(zhuǎn)化生長因子-βRⅡ結(jié)合,促進腫瘤中轉(zhuǎn)化生長因子-β介導的信號傳導,促進腫瘤增殖[5]。Cyclin Y是Rb通路的潛在調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)節(jié)人HCC細胞系的G1/S期轉(zhuǎn)變,可以通過結(jié)合促進CDK4的T172位點磷酸化,促進腫瘤細胞的惡性增殖[6]。Cyclin E1作為一種細胞周期蛋白,能與CDK2的調(diào)節(jié)亞基形成復合物并發(fā)揮其作用,其活性是促進細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。腫瘤中Cyclin E1的過度表達導致染色體不穩(wěn)定,導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究通過分析HCC中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表達,探討其臨床預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以自2015年1月至2016年1月期間于我院診治的84例HCC患者為研究對象。納入標準:(1)均接受HCC切除術(shù),術(shù)后病理診斷明確為HCC。(2)術(shù)前無放化療、TACE及消融治療史。(3)臨床資料完整。(4)患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并肝膿腫、肺炎等感染性疾病。(2)合并其他惡性腫瘤。(3)合并肝腎等器官功能衰竭?；颊吣挲g33～77歲,平均(62.32±6.39)歲;男50例,女34例;腫瘤大小:≤2 cm者43例,>2 cm者41例;采用第六版美國癌癥聯(lián)合會腫瘤TNM分期:Ⅰ期53例,Ⅱ～Ⅲa期31例。病理分級:高中分化58例,低分化26例;甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平:<400 ng/mL 62例,≥400 ng/mL 22例;腫瘤數(shù)目:單發(fā)61例,多發(fā)23例;肝硬化:有62例,無22例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準并通過。

1.2 免疫組化檢測 將癌和癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm以上)放入10%甲醛固定過夜,置入包埋機石蠟包埋,切片機4 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中微波爐煮沸抗原熱修復5 min,滴加3%雙氧水15 min,一抗4℃過夜(CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1抗體購自Abcam公司,貨號ab251041、ab185622、ab237677、ab33911);滴加二抗孵育30 min;辣根過氧化物酶標記三抗孵育30 min,顯色液顯色30 s;蘇木素染核5 min,梯度酒精脫水,樹脂封片。200倍顯微鏡下(日本OLYMBUS,BX53)觀察陽性表達情況,染色評分根據(jù)染色強度(0分:無染色;1分:棕黃色染色;2分:棕褐色染色)乘以染色面積(0分:≤25%;1分:26%～49%;2分:≥50%)。評分<2分為陰性表達,≥2分為陽性表達[8]。

1.3 隨訪 經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為HCC之日開始進行隨訪,以門診復查或電話的方式進行隨訪,前2年每3個月隨訪1次,此后每6個月隨訪1次,隨訪內(nèi)容為患者生存狀態(tài)及疾病復發(fā)進展情況等,隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束,隨訪截止時間為2021年1月。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC癌與癌旁組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA的表達顯著高于癌旁組織,經(jīng)Wilcoxon秩檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.420、3.893、3.122、3.517,均P=0.000)。見圖1。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果,進一步證實癌組織中CAC1 mRNA高表達[HR=1.56(1.10～2.22),P=0.013]、CCNB2 mRNA高表達[HR=1.45(1.06～1.92),P=0.032]、Cyclin Y mRNA高表達[HR=1.83(1.28～2.60),P<0.001]及Cyclin E1 mRNA高表達[HR=1.62(1.14～2.29),P=0.007]HCC患者總體生存預后較差。

注:*P<0.001

2.2 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達的相關(guān)性 利用R語言,采用Pearson相關(guān)分析HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達的相關(guān)性,結(jié)果顯示CAC1、CCNB2、Cyclin Y與Cyclin E1 mRNA表達均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 HCC癌組織中各指標mRNA表達的相關(guān)性

2.3 HCC癌與癌旁組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達 癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y陽性表達主要位于細胞漿和細胞膜,部分位于細胞核;Cyclin E1陽性表達主要位于細胞核,見圖2。癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白的陽性表達率分別為71.43%(60/84)、77.38%(65/84)、69.05%(58/84)、78.57%(66/84),癌旁組織分別為25.00%(21/84)、27.38%(23/84)、19.05%(16/84)、20.24%(17/84),癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織(2=36.261、42.096、42.604、57.175,P=0.000、0.000、0.000、0.000)。見圖2。

圖2 免疫組化檢測癌組織中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1蛋白表達(×200)

2.4 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達與臨床病理特征間的關(guān)系 HCC患者不同腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目的癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),不同HCC患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、AFP水平及肝硬化與CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 HCC中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.5 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達對患者生存預后影響 84例患者隨訪2～60個月,隨訪期間死亡39例,失訪2例,中位總體生存時間為(35.87±7.91)個月,5年總體生存率52.44%(43/82)。CAC1陽性表達組的5年總體生存率為41.38%(24/58),明顯低于陰性表達組患者79.17%(19/24)(Log-rank2=5.430,P=0.020;CCNB2陽性表達組的5年總體生存率為46.03%(29/63),明顯低于陰性表達組患者73.68%(14/19)(Log-rank2=4.237,P=0.040);Cyclin Y陽性表達組的5年總體生存率為42.86%(24/56),明顯低于陰性表達組患者73.08%(19/26)(Log-rank2=6.125,P=0.013);Cyclin E1陽性表達組的5年總體生存率為46.88%(30/64),明顯低于陰性表達組患者72.22%(13/18)(Log-rank2=3.867,P=0.049)。見圖3。

圖3HCC癌組織中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1蛋白表達對患者生存預后影響

3 討論

肝癌是癌癥相關(guān)死亡中第三大死亡原因,預后較差,嚴重威脅我國人民健康。HCC是肝癌最常見的病理類型,HCC的臨床治療包括手術(shù)治療、介入治療、射頻消融及放化療等,但目前仍不能徹底治愈。因此,需深入研究HCC的疾病發(fā)病規(guī)律,探索新的HCC疾病發(fā)生的分子機制,尋找新的HCC早期診斷及預后判斷的腫瘤標志物。腫瘤細胞的失控性增殖是惡性腫瘤的基本生物學特征,涉及細胞周期調(diào)控的紊亂。HCC的發(fā)生、發(fā)展是細胞增殖及異常分化的結(jié)果,其中G1/S期調(diào)控紊亂是HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點,涉及Cyclin、CDK及周期素激酶抑制蛋白構(gòu)成的蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)的功能紊亂[9]。因此,深入研究HCC中Cyclins/CDK的表達及生物學功能對臨床早期診斷及腫瘤的防治具有重大的臨床意義。

CAC1編碼基因位于人類10號染色體(10q35-36),屬于E3泛素連接酶家族成員。近年來發(fā)現(xiàn),在生長因子、有絲分裂原等因子的刺激下,結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中CAC1通過激活CDK2激酶活性,不僅參與促進細胞周期的進行,還參與腫瘤耐藥性的形成[3,10]。本研究發(fā)現(xiàn),HCC癌組織中CAC1蛋白表達明顯升高,提示CAC1可能參與HCC的腫瘤發(fā)生。HCC中CAC1表達升高的機制可能與微小RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。研究表明,微小RNA-199能夠結(jié)合到CAC1 mRNA的3′非編碼區(qū),降低的CAC1 mRNA的穩(wěn)定性,而腫瘤中抑制CAC1表達的微小RNA-199表達下調(diào),導致CAC1過表達,促進腫瘤的惡性增殖[11]。進一步分析發(fā)現(xiàn),腫瘤分期Ⅱ～Ⅲa期及多發(fā)腫瘤的HCC癌組織中CAC1蛋白表達陽性率較高,提示HCC中CAC1蛋白表達升高參與HCC的腫瘤進展。分析其機制,可能與CAC1對下游抑癌基因的調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),CAC1的表達上調(diào)通過促進PML基因的SUMO化修飾,抑制抑癌基因p53的表達,進而促進腫瘤細胞的惡性增殖[12]。此外,CAC1的表達升高還能夠通過促進腫瘤中基質(zhì)金屬蛋酶-19等的表達,促進腫瘤細胞外基質(zhì)的降解,促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移,導致腫瘤進展[13]。

細胞周期受到多種細胞周期蛋白與細胞周期蛋白依賴性激酶的調(diào)控。CCNB2屬于B型細胞周期蛋白。研究表明,CCNB2在G1期合成并在后期迅速降低,腫瘤中CCNB2的過度表達導致G2/M檢查點失效,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究中,HCC癌組織中CCNB2蛋白表達升高,其機制可能是CCNB2受上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中轉(zhuǎn)錄因子HMGA能夠結(jié)合CNNB2基因啟動子區(qū)域的CAAT盒,促進CNNB2的表達[15],而HCC中HMGA表達上調(diào)[16],因此,HCC中HMGA的表達促進CNNB2的表達上調(diào)。此外,HCC癌組織中CNNB2表達與腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān),提示CNNB2參與促進HCC的腫瘤進展。有學者報道,CNNB2的表達增加通過促進細胞G2/M期的進行,促進腫瘤細胞的有絲分裂,促進腫瘤的惡性增殖[14]。除CCNB2外,多種細胞周期蛋白如Cyclin Y、Cyclin E1亦參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)[17-18]。本研究中,HCC癌組織中Cyclin Y、Cyclin E1蛋白表達顯著升高,提示Cyclin Y、Cyclin E1均參與HCC的腫瘤發(fā)生過程。一方面,Cyclin Y的表達上調(diào)可能與上游AMPK信號通路的激活有關(guān)。Dohmen等[19]研究表明,AMPK能夠磷酸化激活其底物Cyclin Y,促進Cyclin Y結(jié)合CDK16,誘導細胞自噬的發(fā)生,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另一方面,HCC中Cyclin E1的表達升高可能與其上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān),研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin E1的表達上調(diào)受到E2F的調(diào)控,E2F通過激活HCC中E2F的表達,促進腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移,導致患者的不良預后[17]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin Y、Cyclin E1陽性表達與較高的腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān),提示Cyclin Y、Cyclin E1可能參與HCC的腫瘤進展。分析其機制,可能與Cyclin Y、Cyclin E1對細胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。其中Cyclin Y能夠與CDK4結(jié)合形成復合體,促進腫瘤G1/S期轉(zhuǎn)換,促進腫瘤增殖[5],而Cyclin E1除能夠促進腫瘤細胞周期G1/S期進行以外,還能通過激活AKT/雷帕霉素靶蛋白信號通路,促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,進而促進腫瘤進展[20]。

本研究進一步分析CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表達與HCC患者生存預后的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1陽性表達的HCC患者生存預后較差,提示檢測HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表達有助于判斷HCC患者生存預后。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達均呈顯著正相關(guān),其中CCNB2與Cyclin E1間為強相關(guān),提示四者在HCC的疾病發(fā)生、發(fā)展過程中存在相互作用的關(guān)系。有學者[21]研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin A、B、E等家族成員受到上游轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,腫瘤發(fā)生時E2F能夠上調(diào)Cyclins的表達,共同促進腫瘤細胞周期的進行,但具體作用及調(diào)控機制有待深入探索。

綜上所述,HCC中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表達上調(diào),四者表達與腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān)。CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1陽性表達的HCC患者生存預后較差,有助于判斷HCC患者的臨床預后。但本研究樣本例數(shù)有限,研究可能存在一定的偏倚,有待今后進行多中心臨床試驗深入研究。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明:方麗負責醞釀和設計實驗、數(shù)據(jù)收集、起草和修訂論文等工作。牛廣旭、吳士茜負責協(xié)助實施研究、部分數(shù)據(jù)的收集和分析以及論文審查和修訂等工作。王靜負責論文編輯和審查,并提供了行政、技術(shù)和材料等方面的支持。