王淑媛, 殷偉, 黃京希, 李晨輝, 周玉珍, 劉益清

湘潭市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科(湖南湘潭 411104)

血紅蛋白病是一類珠蛋白基因變異而導(dǎo)致血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能異常的遺傳病[1],包括異常血紅蛋白病和地中海貧血兩大類,以熱帶和亞熱帶地區(qū)分布較廣。以往針對湖南地區(qū)人群的地中海貧血相關(guān)報(bào)道較多,但對異常血紅蛋白病、尤其是罕見的異常血紅蛋白病的發(fā)生情況報(bào)道較少。本研究通過對2016年7月至2020年6月收集的湖南湘潭地區(qū)76例異常血紅蛋白病進(jìn)行分析,旨在分析本地區(qū)異常血紅蛋白病的分布特征,探討異常血紅蛋白病的分子生物學(xué)特征和臨床表型、為該地區(qū)人群血紅蛋白病的篩查和遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年7月至2020年6月在湘潭市婦幼保健院進(jìn)行婚前檢查、孕期檢查的正常人群及非血液病門診、住院患者作為研究對象,共收集連續(xù)性資料樣本25 516例,年齡0～45歲,其中女24 677例,男839例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)在湘潭市婦幼保健院進(jìn)行婚前檢查、孕期檢查的正常人群及非血液病門診、住院患者。(2)同意采集靜脈血2～4 mL,用于進(jìn)行血細(xì)胞參數(shù)檢測、血紅蛋白電泳分析、地貧基因檢測和珠蛋白基因序列分析。(3)靜脈血標(biāo)本經(jīng)EDTA抗凝,于2～8℃中妥善保存。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并除地貧外的血液學(xué)疾病;(2)合并內(nèi)科慢性貧血性疾病;(3)惡性腫瘤。參與研究對象均簽署知情同意書,本研究已經(jīng)過湘潭市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)(202011)。

1.2 血液學(xué)表型分析 采用BC-6800全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞)進(jìn)行血細(xì)胞參數(shù)檢測。采集并分析血常規(guī)參數(shù):血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)。采用Capillarys 2(Sebia,法國)全自動毛細(xì)管電泳儀及配套試劑進(jìn)行血紅蛋白電泳分析,分區(qū)(Z1-Z15區(qū))鑒別血紅蛋白條帶類型,并分析各條帶所占相對比例含量。針對血液學(xué)檢測結(jié)果,符合以下條件之一的行常見α、β地貧基因檢測:(1)血細(xì)胞參數(shù)檢測MCV<80 fL;(2)MCH<27 pg;(3)血紅蛋白電泳分析Hb A2≤2.5%或Hb A2≥3.5%;符合以下條件之一的行珠蛋白基因Sanger測序:(1)血紅蛋白電泳出現(xiàn)異常條帶;(2)常見α、β地貧基因陰性但血液學(xué)參數(shù)異常。

1.3 常見α、β地中海貧血基因檢測 采用PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)檢測α地貧的3種常見缺失類型(--SEA、-α3.7和-α4.2)和3種常見點(diǎn)突變(αCSα、αQSα和αWSα)、β地貧的17種常見點(diǎn)突變(41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用試劑為亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供的地中海貧血基因檢測試劑盒(注冊證編號:國械注準(zhǔn)20153401272)。操作程序按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 珠蛋白基因測序 采用PCR方法擴(kuò)增α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和β珠蛋白基因, 采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行珠蛋白基因序列測定,于人類異常血紅蛋白和地中海貧血數(shù)據(jù)庫(http://globin.cse.psu.edu/)查找突變位點(diǎn)。珠蛋白基因測序均由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司檢測。

2 結(jié)果

2.1 珠蛋白基因測序結(jié)果 在25 516例樣本中,檢出異常血紅蛋白病76例,血紅蛋白異常檢出率0.29%(76/25 516),其中位于α珠蛋白肽鏈變異類型6種共30例,占比39.5%(30/76),最常見的α珠蛋白變異類型為Hb CS,共24例,占31.6%(24/76),其次為Hb Queens,共2例占比2.63%(2/76),1例少見型異常血紅蛋白Hb Port Phillip(圖1-A)及1例Hb Woodville合并Hb G-Coushatta異常血紅蛋白(圖2-A、B),另外還檢測到1例Hb Q-Thailand 復(fù)合-α4.2雜合子;位于β珠蛋白肽鏈的變異類型6種共46例,占比59.2%(46/76),最常見的β珠蛋白變異類型為HbE,共16例,占21.1%(16/76),其次為Hb New York,共12例,占15.79%(12/76);α合并β珠蛋白肽鏈變異類型1例,占比1.3%(1/76)。異常血紅蛋白變異類型見表1。

表1 異常血紅蛋白變異類型及例數(shù)、構(gòu)成比

注:A:珠蛋白基因測序(HBA2:c.275T>C);B:血紅蛋白毛細(xì)管電泳圖

注:A:珠蛋白基因測序(HBA1:c.19G>T);B:珠蛋白基因測序(HBB:c.68A>C);C:血紅蛋白毛細(xì)管電泳圖

2.2 常見α、β地中海貧血基因檢測結(jié)果 在76例異常血紅蛋白樣本中,經(jīng)PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢出異常血紅蛋白病40例,檢出率52.6%(40/76)。包括Hb CS 24例,Hb E 16例,其中1例Hb CS復(fù)合β地貧雜合子,1例Hb E復(fù)合-α3.7雜合子。由于Hb CS、Hb E既會導(dǎo)致類α與類β珠蛋白比例失衡出現(xiàn)地中海貧血,又會導(dǎo)致異常血紅蛋白產(chǎn)生,本研究中將Hb CS、Hb E納入異常血紅蛋白病討論。

2.3 毛細(xì)管電泳結(jié)果 76例異常血紅蛋白病的電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白條帶(Hb X)70例,檢出率92.11%(70/76)。30例α鏈異常血紅蛋白病中,6例Hb CS沒有檢出異常條帶(5例單純Hb CS雜合子和1例Hb CS復(fù)合β地貧),24例檢出異常條帶。一例少見型異常血紅蛋白Hb Port Phillip電泳圖,在Z8區(qū)有3.7%異常條帶(圖1-B)。Hb CS電泳帶含量普遍較低,在0.5%～1.2%。45例β鏈異常血紅蛋白病均檢出異常條帶(表2)。一例Hb Woodville合并Hb G-Coushatta異常血紅蛋白電泳圖,在Hb S及Hb D區(qū)分別有3%和38.1%異常條帶(圖2-C)。76例異常血紅蛋白病中42例Hb A2值偏離參考區(qū)間。α鏈異常血紅蛋白病表現(xiàn)為Hb A2含量降低(<2.5%),有26例,占比86.7%(26/30);β鏈異常血紅蛋白病表現(xiàn)為Hb A2升高(>3.5%),有16例,占比35.6%(16/45),全部為Hb E(表2)。

表2 異常血紅蛋白病毛細(xì)管電泳檢測情況 例(%)

2.4 血常規(guī)參數(shù) 在13種異常血紅蛋白類型中,有3種(Hb CS、Hb E和Hb Port Phillip)表現(xiàn)為血常規(guī)參數(shù)異常,其他9種類型異常血紅蛋白的單純雜合子血常規(guī)參數(shù)均正常(表3)。單純Hb CS雜合子平均Hb、MCV、MCH在正常范圍,其中有6例Hb<110 g/L,5例MCH異常,1例MCV異常。1例Hb CS雜合子復(fù)合β地貧,其血常規(guī)為中度小細(xì)胞低色素性貧血。單純Hb E雜合子表現(xiàn)為輕度β地中海貧血的血液學(xué)特征,Hb E雜合子復(fù)合-α3.7雜合子,其Hb、MCV和MCH水平較單純Hb E雜合子異常程度減輕。Hb Q-Thailand合并-α4.2雜合子表現(xiàn)為類似靜止型α地貧的特征;Hb Port Phillip雜合子表現(xiàn)為類似輕型α地貧的特征。

表3 異常血紅蛋白的分子特征及血液學(xué)表型

3 討論

異常血紅蛋白病是由于珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起的一組遺傳性血紅蛋白病[2]。基于二代測序技術(shù)平臺的湖南省血紅蛋白病的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,湖南省14個地市異常血紅蛋白病平均發(fā)生率為0.49%[3],本研究通過聯(lián)合血常規(guī)、血紅蛋白電泳、常見地貧基因檢測、Sanger測序4種技術(shù)的方式發(fā)現(xiàn)湘潭地區(qū)異常血紅蛋白病攜帶率為0.298%,提示湖南地區(qū)異常血紅蛋白病分布存在地區(qū)差異性。本研究檢測結(jié)果顯示β鏈異常血紅蛋白病檢出數(shù)多于α鏈異常血紅蛋白病。以Hb CS和Hb E最為常見,其次為Hb New York、Hb G-Coushatta和Hb J-Bangkok。其中Hb CS、Hb E、Hb NewYork和Hb J-Bangkok是南方地區(qū)最常見異常血紅蛋白病[4-7],Hb G-Coushatta在北方常見[8]。湘潭地區(qū)異常血紅蛋白基因有其地區(qū)特異性,既有較高比例的南方人群常見的異常血紅蛋白類型,也有北方人群常見的類型。

本研究中的76例異常血紅蛋白病中,毛細(xì)管電泳檢出異常血紅蛋白條帶70例,檢出率92.11%;其中24例Hb CS中有18例毛細(xì)管電泳檢出異常Hb帶,檢出率75%,未檢出異常血紅蛋白條帶的6例,可能是由于Hb CS化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,在電泳上機(jī)之前發(fā)生了降解[9]。本研究中α鏈異常血紅蛋白中有86.7%的個體Hb A2值偏離參考區(qū)間(<2.5%),而β鏈異常血紅蛋白中僅有35.6%的個體Hb A2值異常(>3.5%)。因?yàn)镠b A2由α和δ珠蛋白組成,α鏈異常導(dǎo)致正常α珠蛋白數(shù)量減少會直接影響Hb A2的量,而β鏈異常是通過使α珠蛋白過剩或者δ珠蛋白代償性表達(dá)上升間接影響Hb A2的量,當(dāng)β鏈異常導(dǎo)致上述兩種情況才會表現(xiàn)Hb A2偏高[10],當(dāng)出現(xiàn)Hb E時,由于β珠蛋白基因突變導(dǎo)致異常血紅蛋白Hb E合成的同時致使正常β珠蛋白表達(dá)減少而導(dǎo)致α珠蛋白過剩[11],本研究中Hb E異常血紅蛋白病也表現(xiàn)出了Hb A2偏高的情況。同時缺鐵性貧血會導(dǎo)致Hb A2表達(dá)水平降低而掩蓋部分β鏈異常導(dǎo)致的Hb A2異常[12],因此,α鏈異常血紅蛋白病表現(xiàn)出Hb A2指標(biāo)異常概率較大,β鏈異常血紅蛋白病表現(xiàn)出Hb A2指標(biāo)異常概率較小,值得臨床關(guān)注。

從血常規(guī)結(jié)果觀察,大多數(shù)的單純異常血紅蛋白病血常規(guī)無異常表型,Hb CS、Hb E、Hb Port Phillip雜合子可表現(xiàn)為Hb、MCV、MCH參數(shù)異常,類似輕型地中海貧血的表現(xiàn)。本研究中檢測結(jié)果顯示,23例單純Hb CS雜合子的血液學(xué)表型正?；蚪咏?。官志揚(yáng)等[13]報(bào)道,Hb CS雜合子對β地中海貧血的血液學(xué)參數(shù)無顯著影響,輕型β地貧的表現(xiàn)可掩蓋Hb CS雜合子的存在。本研究中1例Hb CS雜合子復(fù)合β地貧,表現(xiàn)為β地貧的血液學(xué)特點(diǎn),但貧血程度加重,為中度貧血。分析可能是由于個體差異或該病例為孕婦存在生理性貧血的可能。提示當(dāng)Hb CS合并地中海貧血時表現(xiàn)可能有較大差異,同時Hb CS穩(wěn)定差,在雜合子中含量低,所以Hb CS雜合子通過血常規(guī)和血紅蛋白電泳篩查可能出現(xiàn)漏篩,在臨床咨詢中應(yīng)加以重視。本研究中檢出Hb E 16例,15例Hb E雜合子的血液學(xué)表型與β+地中海貧血相似,1例Hb E合并α+地貧,其血液學(xué)表型與單純Hb E雜合子相似但更輕微。這是因?yàn)棣轮榈鞍谆?6位密碼子突變導(dǎo)致Hb E合成的同時會致使β珠蛋白表達(dá)減少,當(dāng)Hb E合并α+地貧時,α和β珠蛋白表達(dá)同時減少,一定程度上緩解了單純Hb E或α+地貧時α和β珠蛋白的不平衡[11]。該病例提示Hb E的出現(xiàn)會掩蓋α+地貧的存在,臨床分析時應(yīng)引起注意。Hb Port Phillip是α鏈異常血紅蛋白病,首次報(bào)道見于1977年新西蘭1例華裔女性[14],國內(nèi)深圳[15]曾報(bào)道一例出生10日齡新生兒,血液分析提示小細(xì)胞低色素性貧血,未行血紅蛋白電泳檢測。本研究中Hb Port Phillip病例為一個8個月的男孩,Hb電泳在Z8區(qū)有3.7%異常條帶,Hb A2在正常范圍,輕度小細(xì)胞低色素性貧血,Hb Port Phillip是一種可以引起α地中海貧血表型的異常血紅蛋白[15],當(dāng)其復(fù)合地貧尤其是α地貧時可能加重原有地貧的臨床表型。因此,在臨床遺傳咨詢時應(yīng)加以注意。

其他少見型異常血紅蛋白中,Hb Woodville首次于越南報(bào)道[16],為1例無異常臨床表現(xiàn)及血液學(xué)表型的婦女,發(fā)現(xiàn)有9%異常血紅蛋白。國內(nèi)目前僅有佛山報(bào)道[17]1例。本例為Hb Woodville雜合子復(fù)合Hb G-Coushatta雜合子突變,無異常臨床表現(xiàn),電泳發(fā)現(xiàn)3%和38.1%異常條帶,單純Hb Woodville雜合突變的異常帶含量一般為9%[16],而Hb Woodville血紅蛋白既可能由α1基因突變導(dǎo)致,又可能由α2基因突變導(dǎo)致,且α2基因是α1基因表達(dá)量的2倍[11],本例因?yàn)橥蛔兓蛭挥讦?基因使得異常條帶含量較低。單純Hb Woodville或Hb G-Coushatta雜合突變氨基酸殘基位于血紅蛋白的外部,未影響到血紅蛋白結(jié)構(gòu)及功能,因此,血液學(xué)表型無血常規(guī)異常,在毛細(xì)管電泳顯示有異常血紅蛋白條帶。此外,本研究檢出1例Hb Q-Thailand復(fù)合-α4.2地貧基因,除有28.4%異常Hb帶外,其他血液學(xué)表型與-α4.2地貧無明顯差異,與既往文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道一致。

多數(shù)雜合子異常血紅蛋白病并沒有明顯的臨床癥狀,少數(shù)異常血紅蛋白可以引起地中海貧血的表型,尤其當(dāng)這些異常血紅蛋白復(fù)合地貧時可改變原有的臨床表型。因此在血紅蛋白電泳篩查出異常條帶后,有必要對異常血紅蛋白病進(jìn)行基因檢測確診,特別是對孕婦或計(jì)劃生育的夫婦根據(jù)不同的異常血紅蛋白病基因型,進(jìn)行遺傳咨詢和生育指導(dǎo)。

利益相關(guān)聲明:不存在競爭經(jīng)濟(jì)利益。

作者貢獻(xiàn)說明:黃京希、李晨輝、周玉珍、劉益清負(fù)責(zé)資料收集和整理;王淑媛、殷偉負(fù)責(zé)方案設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析、論文撰寫。