施 童，陳 杰，亓傳仁，李國學(xué)，羅文海，徐志程※

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)田土壤污染防控與修復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部資源循環(huán)利用技術(shù)與模式重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100125）

0 引言

隨著中國經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展以及人民生活水平持續(xù)提高，生活垃圾的產(chǎn)生量與日俱增。已有統(tǒng)計(jì)表明，2021 年生活垃圾的產(chǎn)生量已達(dá)27 119 萬t，并且隨著全國各地垃圾分類政策的有效落實(shí)，生活垃圾的整體處理率已達(dá)99.88%。在分類政策實(shí)施后，廚余垃圾這一生活垃圾重要組成主體的雜質(zhì)含量顯著降低，提高了其資源化利用潛力，但整體的資源化利用率仍然較低。目前，廚余垃圾的資源化處理技術(shù)主要包括好氧堆肥和厭氧發(fā)酵。其中，好氧堆肥因其具有運(yùn)行操作簡單、過程易于控制，并且能夠產(chǎn)生有機(jī)肥等優(yōu)勢，已成為廚余垃圾的常用處理方式之一。然而，分類后的廚余垃圾有機(jī)質(zhì)含量、含水率及體系致密度均顯著提升，導(dǎo)致其在堆肥過程中存在啟動升溫難、滲濾液產(chǎn)量大、惡臭氣體排放嚴(yán)重、產(chǎn)物腐熟度低等問題，從而易造成更為嚴(yán)重的二次環(huán)境污染問題[1]。

為解決廚余垃圾堆肥的瓶頸問題，常采用物料復(fù)配、工藝參數(shù)調(diào)控以及功能材料介導(dǎo)等策略，改善堆肥過程的物料理化特性，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分固持和腐熟度提升。其中，將高碳源農(nóng)林廢棄物作為輔料進(jìn)行堆肥性能改善的效果已得到有效證實(shí)，并已廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。目前，常用的堆肥輔料包括玉米秸稈、菌糠、園林廢棄物、果蔬廢棄物等[2-3]。通過輔料添加，能夠有效彌補(bǔ)廚余垃圾含水率高、孔隙度差、碳氮比低等缺點(diǎn)，為好氧微生物生長代謝活動提供良好環(huán)境，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的降解轉(zhuǎn)化。例如，歐蓓等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在廚余垃圾堆肥過程中添加秸稈，能在高溫期有效促進(jìn)芽孢桿菌（Bacillus）等好氧微生物的生長繁殖，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)降解和堆體升溫。此外，農(nóng)林輔料富含木質(zhì)纖維素和腐殖質(zhì)前驅(qū)物（例如多酚），能夠在堆肥過程中轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的腐殖質(zhì)，提高產(chǎn)品腐熟度[3,5]。魏自民等[6]分別以果蔬、雞糞和秸稈為原料開展好氧堆肥試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)纖維素含量高的物料更有利于腐殖酸（humic acid，HA）合成，堆肥產(chǎn)品腐熟度更高。此外，不同高碳源農(nóng)林輔料的孔隙度、碳氮比等理化特性也會顯著改變好氧堆肥物料理化特性和微生物演替和功能特征，進(jìn)而影響發(fā)酵性能[7]。然而，目前針對不同農(nóng)林廢棄物作為輔料對廚余垃圾堆肥過程腐殖化的影響及其響應(yīng)的微生物驅(qū)動機(jī)制仍不清楚。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展與普及，擴(kuò)增子測序技術(shù)已逐漸應(yīng)用于堆肥領(lǐng)域中，用于分析堆肥過程中微生物群落的組成及演替情況，揭示相關(guān)指標(biāo)變化的潛在原因，從而為提升堆肥性能提供理論依據(jù)。此外，為進(jìn)一步利用擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)分析菌群潛在功能，近年來開發(fā)了諸多微生物功能預(yù)測工具，例如整合已發(fā)表可培養(yǎng)菌文獻(xiàn)的原核生物功能數(shù)據(jù)庫Functional Annotation of Prokaryotic Taxa（FAPROTAX）和 Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States（PICRUSt）[8-10]。其中，F(xiàn)APROTAX能夠基于16S 測序序列，注釋碳氮硫等常見元素的生物地球化學(xué)循環(huán)功能，已逐漸應(yīng)用于堆肥領(lǐng)域，用于進(jìn)一步揭示堆肥腐殖化和污染氣體產(chǎn)排的微生物功能機(jī)制。

因此，本研究旨在對比評價(jià)玉米秸稈、園林廢棄物和西瓜秧三種常見的高碳源農(nóng)林廢棄物作為輔料對廚余垃圾堆肥過程有機(jī)質(zhì)腐殖化調(diào)控的作用與微生物驅(qū)動機(jī)制。通過測定有機(jī)質(zhì)組分、腐殖質(zhì)及其前驅(qū)物等指標(biāo)，研究不同輔料對堆肥腐殖化的影響；在此基礎(chǔ)上，利用FAPROTAX 和16S rRNA 高通量測序技術(shù)，解析堆肥過程微生物群落結(jié)構(gòu)與功能演替，并最終篩選能夠有效提升廚余垃圾堆肥腐殖化的輔料類型。本研究結(jié)果將對選取適宜的輔料強(qiáng)化廚余垃圾堆肥產(chǎn)品品質(zhì)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以廚余垃圾作為堆肥主料，選用園林廢棄物、玉米秸稈和西瓜秧3 種北京地區(qū)常見的農(nóng)林廢棄物分別作為輔料[11]，進(jìn)行協(xié)同好氧堆肥研究。其中園林廢棄物主要由城市綠化過程中產(chǎn)生的園林剪枝構(gòu)成。廚余垃圾取自北京某垃圾集中處理中心，玉米秸稈、園林廢棄物和西瓜秧取分別取自北京市某農(nóng)場、某園林綠化公司及周邊農(nóng)田。廚余垃圾由28.9%蔬菜、18.7%水果、38.0%餐廚、3.0%骨頭、1.4%樹葉和10.0%塑料等其他垃圾（濕質(zhì)量）組成。堆肥前，去除骨頭、紙屑及塑料等不可降解垃圾。園林廢棄物、玉米秸稈和西瓜秧在試驗(yàn)前風(fēng)干并粉碎至粒徑為2～5 cm。堆肥物料的初始理化特性如表1 所示。

表1 堆肥物料基本理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of composting materials

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)設(shè)備采用實(shí)驗(yàn)室密閉堆肥發(fā)酵罐，有效容積為120 L。發(fā)酵罐配備可移動蓋，蓋子設(shè)置兩個(gè)孔洞，用于氣體采集和插入桿狀溫度傳感器。發(fā)酵罐底部設(shè)置有一個(gè)進(jìn)氣口和一個(gè)帶閥門的滲濾液出口。進(jìn)氣口與氣泵相連，維持氣體穩(wěn)定供應(yīng)。距發(fā)酵罐底部5 cm 處配置多孔鋼板（孔徑3 mm），同時(shí)用于支撐物料和保證均勻通風(fēng)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究共設(shè)置4 個(gè)處理，以不添加輔料為對照處理（記為CK），其他3 個(gè)處理以廚余垃圾作為主料，分別添加園林廢棄物、西瓜秧、玉米秸稈作為輔料進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，分別記為GW、WS 和CS。根據(jù)前期研究結(jié)果[5]，廚余垃圾和輔料的添加比例設(shè)置為17:3（基于濕質(zhì)量），通風(fēng)速率為0.36 L/(kg · min)，過程采用連續(xù)通風(fēng)。本研究堆肥周期設(shè)置為16 d，主要模擬反應(yīng)器堆肥實(shí)際工程運(yùn)行的一次快速發(fā)酵，即溫度降低至室溫停止。試驗(yàn)過程中每天記錄堆體溫度，分別在堆肥第0、4、8、12、16 d 進(jìn)行人工翻堆，采用多點(diǎn)取樣法在物料混合后取約500 g 固體樣品。樣品分為3 份，其中一份樣品使用烘箱在105 ℃條件下烘干，測定物料含水率；一份儲存在-20 ℃冰箱中，用于測定物料基本理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)；另一份自然風(fēng)干，經(jīng)粉碎后測定油脂、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、總碳（TC）、碳氮比（C/N）和腐殖質(zhì)等指標(biāo)。

1.4 測定方法

1.4.1 理化指標(biāo)

堆肥溫度采用長桿狀溫度計(jì)，每 d 早中晚共測定3 次；氧氣濃度采用便攜式沼氣分析儀（Biogas 5 000，Geotech，英國）測定。含水率使用烘箱在105 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量后測定。C/N 和TC 利用元素分析儀（vario MACRO cube，德國）進(jìn)行測定。

pH 值、電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）、種子發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）值測定：將堆肥樣品和蒸餾水以1:10（質(zhì)量體積比）的質(zhì)量和體積比進(jìn)行混合，恒溫?fù)u床振蕩30 min 后，用定量濾紙過濾，取上清液，提取固體樣品的水浸提液作為待測液。其中pH值和EC 值分別采用PHSJ-4F 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（雷磁，中國）和DDSJ-318T 型電導(dǎo)率儀（雷磁，中國）測定。GI 測定參照《有機(jī)肥料：NY/T 525—2021》標(biāo)準(zhǔn)，在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中加入5 mL 浸提液，均勻放入10 粒蘿卜種子，蓋上皿蓋。每個(gè)樣品設(shè)置4 個(gè)重復(fù)，對照為蒸餾水；在25 ℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h，測量根長和統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，通過以下公式計(jì)算：

1.4.2 有機(jī)質(zhì)組分

纖維素、半纖維素、木質(zhì)素使用纖維分析儀（ANKOM220，美國）通過范式纖維測定法測定，稱?。?±0.01）g 樣品，加入酸性洗滌劑1 000 mL 后煮沸1 h，坩堝過濾后用300 mL 90 ℃熱水洗滌多次，再用丙酮洗滌2～3 次至濾液無色；于105 ℃烘箱中烘5 h，冷卻后稱質(zhì)量并計(jì)算。

油脂采用乙醚索氏提取法測定[12]，?。?±0.01）g混勻后的試樣，加入石英砂約20 g，于沸水浴上蒸干，再在（100±5）℃干燥30 min，后全部移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)不斷回流抽提。水浴蒸干接收瓶后再干燥冷卻、稱量，重復(fù)以上操作到恒質(zhì)量為止（誤差≤2 mg）。

粗蛋白采用凱式定氮法測定，稱?。?±0.01）g 充分混勻的固體試樣，加入硫酸銅0.4 g、硫酸鉀6 g 及硫酸20 mL 于消化爐進(jìn)行消化；消化爐溫度達(dá)到420 ℃后，繼續(xù)消化1 h，此時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀,取出后冷卻，再加入水50 mL，于自動凱氏定氮儀（Kjeltec 8400，瑞典）上蒸餾、自動加液、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)。

揮發(fā)性固體（volatile solids，VS）測定采用灼燒法，將稱取的樣品在馬弗爐（550）℃中灼燒至恒質(zhì)量，根據(jù)張黎陽[13]的方法計(jì)算。

1.4.3 腐殖質(zhì)前驅(qū)物

參考堆肥腐殖化機(jī)制解析的相關(guān)研究，確定如下腐殖質(zhì)前驅(qū)物測定方法[14-15]。多酚采用福林酚比色法測定[16]，取0.5 mL 制備好的乙醇粗提液于50 mL 容量瓶中，加入9.5 mL 蒸餾水，搖勻后加入0.5 mL 福林試劑，混勻后加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，充分混合后定容，在30 ℃避光的條件下放置0.5 h，空白對照為未添加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光值采用紫外可見分光光度儀（華辰，中國），在760 nm 下測定，每個(gè)樣品平行測定3 次。

氨基酸采用茚三酮比色法測定[17]，先取1 mL 樣品液，再加入1 mL pH 值為5.4，2 mol/L 醋酸緩沖液和1 mL 茚三酮顯色液，混勻后于100 ℃沸水中加熱15 min，后用自來水冷卻。放置5 min 后，加入3 mL 60%乙醇稀釋，搖勻后，吸光值測定采用紫外可見分光光度儀，在570 nm 下測定（生成的顏色在60 min 內(nèi)穩(wěn)定）。氨基酸含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照后確定。還原糖使用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定[18]，吸取5.0 mL 堿性酒石酸銅甲液和5.0 mL 堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL 錐形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠，從滴定管滴加比預(yù)測體積少1 mL 的試樣溶液至錐形瓶中，在2 min 內(nèi)加熱至沸騰，保持沸騰繼續(xù)以2 s/滴的速度滴定，終點(diǎn)為藍(lán)色剛好褪去，記錄消耗樣液的體積。

還原糖含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出?？扇苄远嗵遣捎米贤饪梢姺止夤舛葍x，通過蒽酮比色法分析，準(zhǔn)確稱?。?±0.01）g 樣品用乙醇沉淀多糖，然后用熱水分次溶解沉淀并稀釋定容至250 mL，隨后過濾，得到待測液；制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在620 nm 波長下，測定吸光度，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定待測液吸光度，從而求得樣品中可溶性多糖含量。

1.4.4 腐殖質(zhì)組成

腐殖質(zhì)（humus，HS）、腐殖酸（humic acid，HA）、富里酸（fulvic acid，F(xiàn)A）和胡富比（humic acid/fulvic acid，HA/FA）：取1 g 風(fēng)干樣品溶解于20 mL 提取液（0.1 mol/L 氫氧化鈉與0.1 mol/L 焦磷酸鈉（體積比1∶1）），于室溫條件下振蕩30 min 后離心（4 000 r/min，15 min），用0.45 μm 濾膜過濾上清液（保證上清液清亮）。濾渣重復(fù)3 次上述操作（至浸提液近乎無色），混合4 次濾液后得到的即為HS 溶液。吸取20 mL HS 溶液，用6 mol/L 鹽酸溶液酸化至pH 值為1，充分?jǐn)嚢韬箪o置12 h，次日在4 000 r/min 條件下離心10 min，F(xiàn)A 為所得上清液，HA 為沉淀。所得沉淀用0.1 mol/L NaOH溶解后得到HA 溶液，HS、FA 和HA 含量均采用總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）分析儀（SHIMADZU，日本島津公司）測定TOC 進(jìn)行表征[19]。HA/FA 為測得的HA 含量與FA 含量之比。

1.4.5 微生物指標(biāo)測定

本研究委托深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司進(jìn)行16S rRNA 高通量測序。首先，使用FastDNA SPIN Kit for Soil DNA 抽提試劑盒（MP Biomedicals,USA）從樣品中提取基因組DNA。提取DNA 的質(zhì)量和濃度使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop-2000 光譜儀（NanoDrop technology,Wilmington,USA）確定。使用細(xì)菌通用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物515F（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）對細(xì)菌的16S rRNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后在Illumina MiSeq 平臺上測序。使用QIIME2 管道對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以獲得擴(kuò)增子序列變異體（ASV）的特征表[20]，然后將其與預(yù)先訓(xùn)練的GREENGENES 13_8數(shù)據(jù)庫對齊，以獲得基于99%相似性水平的分類表[21]。然后使用QIIME2 特征表插件過濾被污染的線粒體和葉綠體序列；隨后使用QIIME2 中的核心多樣性插件計(jì)算多樣性指標(biāo)。此外，使用FAPROTAX 數(shù)據(jù)庫對微生物群落功能進(jìn)行預(yù)測，并將與C 循環(huán)和有機(jī)質(zhì)降解相關(guān)的細(xì)菌功能進(jìn)行提取分析。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析方法

網(wǎng)絡(luò)分析采用Cytoscape（3.9.1）中的“CoNet”應(yīng)用程序，構(gòu)建腐殖化與優(yōu)勢菌群之間的相關(guān)性，兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的Spearman 相關(guān)系數(shù)設(shè)置為r＞0.7（P＜0.05），得到原始網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)，利用Gephi 0.9.2 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。其余數(shù)據(jù)圖均使用Origin 2022 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程基本理化特性變化

在堆肥過程中，添加輔料的CS、GW 和WS 處理具有相似的溫度變化趨勢，均經(jīng)歷了升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期（圖1a）。相比之下，純廚余垃圾的CK處理在堆肥過程中未出現(xiàn)顯著升溫，主要是由于廚余垃圾較高的含水率和致密度，導(dǎo)致氧氣難以在堆體內(nèi)有效擴(kuò)散，并且廚余垃圾也具有較高濃度的油脂和鹽分，從而難以滿足好氧微生物生存活動的基本條件[22]。隨著有機(jī)質(zhì)的不斷降解，添加輔料的處理在堆肥第3 天即達(dá)到55 ℃以上，進(jìn)入高溫期，并在第9 天達(dá)到峰值溫度（＞ 75 ℃），隨后逐漸降低。值得注意的是，添加輔料的處理在第4 和第8 天的溫度出現(xiàn)明顯上升，可能是由于翻堆緩解了堆體異質(zhì)性，并重新混勻了功能微生物，從而促進(jìn)了有機(jī)物的進(jìn)一步降解[23]。堆肥10 d 后，溫度逐漸下降，且翻堆后也未有顯著的溫度上升，表明易降解有機(jī)質(zhì)基本降解完全，堆肥已進(jìn)入降溫腐熟期。相較于園林廢棄物和西瓜秧，添加玉米秸稈能夠更有效地促進(jìn)堆體升溫，在第9 天可達(dá)78 ℃以上，且持續(xù)了更長時(shí)間高溫期。這可能是由于玉米秸稈較好的持水性和孔隙結(jié)構(gòu)，改善了堆體通風(fēng)條件，優(yōu)化了好氧微生物生境，從而加速了微生物對有機(jī)物的降解作用[24]。而由于園林廢棄物中木質(zhì)素含量較高，導(dǎo)致GW 處理升溫效果相對較差。相比之下，由于西瓜秧富含蛋白質(zhì)等易降解有機(jī)物，使得WS 處理在前4 d 升溫最快；但隨著易降解組分在堆肥前8 d 被快速降解，使得WS 處理的溫度逐漸低于其他處理。O2與好氧微生物的代謝活性相關(guān)[25]，由于堆肥過程有機(jī)物生物降解需要利用O2作為終端電子受體，因此各處理的O2含量與溫度變化呈現(xiàn)相反趨勢（圖1b）。相較于GW 和WS 處理，CS 處理在堆肥的第12～16 d O2含量相對較低，進(jìn)一步證實(shí)了玉米秸稈添加有助于促進(jìn)堆肥過程有機(jī)質(zhì)降解，從而延長堆肥高溫期。

圖1 堆肥過程基本理化性質(zhì)變化Fig.1 Changes of basic physiochemical characteristics during composting

除CK 處理外，其他處理的堆體pH 值在堆肥第一周均呈現(xiàn)顯著上升趨勢，隨后逐漸趨于穩(wěn)定（圖1c）。初始階段pH 值的升高主要是由于隨著堆肥溫度升高，部分有機(jī)酸逐漸揮發(fā)或被體系中產(chǎn)生的NH3中和[26]。值得注意的是，WS 處理的pH 值在堆肥前4 d 迅速升至8.0以上，而CS 和GW 處理的pH 變化并不顯著，可能是由于西瓜秧中含有更多易降解有機(jī)氮（表1），能夠促進(jìn)NH3產(chǎn)生，從而加速了有機(jī)酸的中和。EC 值是影響植物生長的重要因素之一[27]，與pH 值不同，所有添加輔料處理的基質(zhì)EC 值在堆肥過程中波動下降（圖1d），主要是由于NH4+等無機(jī)離子以氣體形式散逸及有機(jī)酸、還原糖等小分子物質(zhì)逐漸合成為大分子腐殖質(zhì)[28]。由于玉米秸稈良好的物理空間結(jié)構(gòu)，為微生物的生長繁殖提供了良好的環(huán)境[29]，同時(shí)促進(jìn)了小分子物質(zhì)的固持，所以CS 處理的EC 值較其他處理下降更為迅速。到堆肥結(jié)束時(shí)，添加輔料處理的最終pH 和EC 均值符合有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)（NY 525-2021）。

在堆肥過程中，隨著有機(jī)物的降解，添加輔料的處理TC 含量總體呈下降趨勢（圖1e）。然而，CK 處理的TC 含量在整個(gè)堆肥過程變化并不顯著，主要是由于純廚余垃圾堆肥過程中，堆體結(jié)構(gòu)致密，微生物難以存活，從而限制了有機(jī)碳降解礦化。相比之下，CS 處理的TC 含量在堆肥前4 d 顯著下降，可能是由于玉米秸稈較好的孔隙結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，能夠通過調(diào)節(jié)堆體的自由空域，促進(jìn)氧氣擴(kuò)散，從而加強(qiáng)微生物生長繁殖，推動有機(jī)質(zhì)分解[29]。然而，隨著堆肥進(jìn)行，CS 處理的TC 含量逐漸升高，并在堆肥結(jié)束時(shí)高于其他處理。這可能是因?yàn)樘砑佑衩捉斩捀欣趶N余垃圾堆肥過程多糖等小分子物質(zhì)聚合形成腐殖質(zhì)，從而促進(jìn)碳素固持[30]。

添加輔料各處理的GI 值均不斷上升（圖1f），在堆肥結(jié)束時(shí)達(dá)到80%以上，表明堆肥已達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)（NY 525-2021）。相比之下，由于CK 處理中有機(jī)質(zhì)降解緩慢，且存在大量有機(jī)酸，從而限制了種子萌發(fā)[31]，導(dǎo)致GI 值始終低于5%。相較于其他添加輔料處理，CS處理在堆肥結(jié)束時(shí)具有較高的GI 值（139%），可能是由于玉米秸稈添加促進(jìn)腐殖質(zhì)前驅(qū)物固定為腐殖質(zhì)，提高了堆肥腐熟度[32]。

2.2 有機(jī)組分含量變化

相較于純廚余垃圾，添加不同輔料均能促進(jìn)廚余垃圾堆肥過程的有機(jī)質(zhì)降解轉(zhuǎn)化。在整個(gè)堆肥過程中，CS、GW 和WS 處理的粗蛋白、油脂、半纖維素和纖維素含量總體呈現(xiàn)下降趨勢。并且在堆肥前8 d 下降最為明顯（圖2a～2d）。這可能是因?yàn)榇值鞍?、油脂、半纖維素和纖維素具有易降解特性，因此在堆肥升溫期和高溫期能夠被微生物優(yōu)先利用降解[33]。相比之下，由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不利于微生物利用，導(dǎo)致其降解主要出現(xiàn)在高溫期和降溫期（第4～16 天）（圖2e）。其中，WS處理在堆肥前8 d，粗蛋白含量下降速度較CS、GW 處理更快，可能是因?yàn)槲鞴涎碇写嬖诟嘁捉到馕镔|(zhì)（如蛋白質(zhì)和淀粉），能夠更有效地被微生物作為碳源使用，從而也使其升溫速度相對較快[34]。然而，相較于WS 處理，CS 和GW 處理中木質(zhì)纖維素含量的下降速率更高，特別是CS 處理尤為顯著，可能是由于秸稈中的木質(zhì)纖維素含量較高且比表面積較大，提高了微生物利用的可及性，有利于后續(xù)的腐殖化過程[35]。

圖2 廚余垃圾堆肥過程有機(jī)組分含量變化Fig.2 Changes in organic components content during kitchen waste composting

在堆肥過程中，隨著蛋白質(zhì)、油脂及木質(zhì)纖維素的降解，堆肥物料的VS 整體呈現(xiàn)下降趨勢（圖2f）。相比于其他兩種處理，GW 處理的VS 降幅相對較小，主要是因?yàn)閳@林廢棄物的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且含有較高木質(zhì)素，不利于微生物降解[36]。相較之下，添加玉米秸稈的CS處理中有效碳源更多，使得堆肥過程VS 的降解更快。

2.3 堆肥過程腐殖化變化

相關(guān)研究表明，堆肥過程中有機(jī)質(zhì)的降解將產(chǎn)生氨基酸、多酚、可溶性多糖和還原糖等中間產(chǎn)物，與腐殖質(zhì)的形成緊密相關(guān)[37]。因此，本研究在分析有機(jī)質(zhì)降解的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了在廚余垃圾堆肥過程中典型腐殖質(zhì)前驅(qū)物以及腐殖質(zhì)的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化。

添加輔料處理的腐殖質(zhì)前驅(qū)物含量均呈現(xiàn)在堆肥高溫期升高隨后逐漸降低的變化趨勢（圖3a～3d），而純廚余垃圾堆肥的腐殖質(zhì)前驅(qū)物含量在整個(gè)周期中并沒有發(fā)生顯著變化。其中，氨基酸的變化主要是由于廚余垃圾中蛋白質(zhì)在高溫期被微生物迅速分解形成了氨基酸類小分子物質(zhì)[6]，隨著堆肥進(jìn)行，體系中蛋白質(zhì)被消耗殆盡，并且微生物腐殖化作用逐漸增強(qiáng)，氨基酸態(tài)氮向腐殖質(zhì)形態(tài)的氮轉(zhuǎn)化[6]。在堆肥前8 d，WS 處理氨基酸含量明顯高于CS 和GW 處理，可能是由于西瓜秧具有更高的蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)了氨基酸產(chǎn)生。

圖3 堆肥過程腐殖化變化Fig.3 Changes of humification during composting

隨著纖維素和半纖維素的逐漸分解，體系中可溶性多糖和還原糖的含量在堆肥高溫期逐漸上升。與WS 處理相比，其他添加輔料處理的可溶性多糖含量較高，可能是由于其較快的木質(zhì)纖維素降解，促進(jìn)了可溶性多糖和多糖的生成[38]。值得注意的是，GW 和WS 處理的還原糖濃度在第4 天達(dá)到最大值，而CS 處理的還原糖濃度在第4 天繼續(xù)增加，第8 天達(dá)到最大值。這可能是由于隨著堆肥溫度的升高，纖維素、半纖維素的分解速度加快，使得還原糖濃度持續(xù)增加；其中，GW 和WS 處理在初始階段有機(jī)質(zhì)降解和堆肥升溫較快，特別是WS處理最為顯著，從而促進(jìn)了還原糖的快速產(chǎn)生，但由于GW 和WS 處理的纖維素和半纖維素含量低于CS 處理，致使其還原糖含量于第4 天達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。相比之下，添加玉米秸稈改善了廚余垃圾堆肥過程的通風(fēng)效果，使相關(guān)的微生物生存條件得到了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了纖維素、半纖維素在堆肥高溫期的持續(xù)分解，CS 處理的還原糖含量于堆肥第8 天達(dá)到最大值。

多酚通常是指分子量在600 Da 以上并且包含多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，在堆肥過程中，多酚會在多酚氧化酶作用下形成苯醌類物質(zhì)，最終合成腐殖質(zhì)[39]。因此，在富含木質(zhì)纖維素的堆肥中通?？梢援a(chǎn)生更過多酚，進(jìn)而促進(jìn)HA 合成[40]。不同于氨基酸的產(chǎn)生，堆肥前8 d多酚含量的升高可能是由于物料中木質(zhì)素的降解轉(zhuǎn)化。盡管木質(zhì)素在堆肥前期降解較慢，但分解產(chǎn)生的多酚不易被為礦化，且此時(shí)腐殖化作用較為緩慢，因此促進(jìn)了堆肥前期多酚的積累[41]。然而，隨著前驅(qū)物的不斷產(chǎn)生和積累，多酚能夠與可溶性多糖、氨基酸等中間產(chǎn)物發(fā)生縮合反應(yīng)，促進(jìn)腐殖質(zhì)的合成[42]，使得多酚含量在堆肥后期持續(xù)下降。值得注意的是，在堆肥第8 天，CS 處理的多酚濃度相較于GW、WS 兩種處理更高，可能是因?yàn)槠涓叩哪举|(zhì)素降解效率，促進(jìn)了多酚產(chǎn)生，進(jìn)而通過氧化酶催化形成苯醌類物質(zhì)，促進(jìn)腐殖質(zhì)合成[43]。

添加輔料處理的HS 含量在整個(gè)堆肥過程呈現(xiàn)波動上升趨勢（圖3e）。具體而言，CS、GW 和WS 處理的FA 含量在堆肥進(jìn)入高溫期后開始快速下降（圖3g）。已有研究表明，在堆肥過程中FA 一部分會被微生物作為碳源礦化，而另一部分則進(jìn)一步合成穩(wěn)定的HA[44]。因此，從堆肥第4 天開始，所有添加輔料處理的HA 含量及HA/FA 值開始逐漸上升。此外，多酚、氨基酸及還原性糖等腐殖質(zhì)前驅(qū)物的產(chǎn)生也是HA 升高的重要原因[45]。其中，CS 處理的HS 和HA 含量較其他處理提高6%～75%，主要原因是添加玉米秸稈能夠加速纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)的降解以及腐殖質(zhì)前驅(qū)物的合成（圖2），從而使堆肥腐殖化進(jìn)一步增強(qiáng)[44]。

2.4 微生物群落的動態(tài)變化

在分析堆肥過程基本理化特性及腐殖化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，對門和屬水平的細(xì)菌群落演替特征進(jìn)行分析，用于揭示三種高碳源輔料對廚余垃圾堆肥過程腐殖化影響的關(guān)鍵機(jī)制（圖4）。在門水平細(xì)菌群落中，優(yōu)勢菌門主要包括變形菌門（Pseudomonadota）、厚壁菌門（Firmicute）和擬桿菌門（Bacteroidota），總相對豐度達(dá)80%以上（圖4a），其中，F(xiàn)irmicute在整個(gè)堆肥過程占據(jù)主導(dǎo)地位（圖4a）。在堆肥起始階段，F(xiàn)irmicute 中的優(yōu)勢菌屬為巨球型菌（Megasphaera）和乳桿菌（Lactobacillus）（圖4b），這些菌屬已被證明廣泛存在于廚余垃圾中，導(dǎo)致廚余垃圾腐敗酸化，降低堆肥初始pH[5]。隨著堆肥進(jìn)入高溫期，F(xiàn)irmicute的相對豐度小幅度下降，且芽孢類的嗜熱菌屬成為優(yōu)勢菌屬，包括解脲芽孢桿菌屬（Ureibacillus），芽孢桿菌（Bacillus）和單胞芽孢桿菌（Sinibacillus）。研究表明，芽孢桿菌類菌屬具有嗜熱性，能夠在堆肥高溫期通過分泌蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶等功能酶，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物快速降解轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)腐殖質(zhì)生成[46]。與WS處理相比，其他兩種添加輔料的處理在堆肥高溫期具有較高豐度的Ureibacillus和Bacillus，導(dǎo)致大分子有機(jī)物的快速轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了多酚、氨基酸及還原糖等前驅(qū)物形成。此外，Thermobacillus的豐度在高溫期有所增加。RAKOTOARIVONINA 等[47]研究表明，Thermobacillus能夠產(chǎn)生木質(zhì)纖維素分解酶，使木質(zhì)素等難降解有機(jī)物的降解更快。相比于WS 處理，該菌屬在GW 和CS 處理高溫期豐度更高，促進(jìn)了堆肥過程纖維素和半纖維素含量的快速下降（圖3c 和3d）。隨著堆肥進(jìn)入降溫期，F(xiàn)irmicutes 相對豐度顯著下降（圖4a），主要是由于溫度降低，減小了堆體的環(huán)境過濾作用，提高了菌群的多樣性和豐富度[48]。此時(shí)，F(xiàn)irmicutes 的主要菌屬變?yōu)閿M諾卡菌屬（Novibacillus）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus），這兩種菌屬能夠分解纖維素、木質(zhì)素、3-葡聚糖和甲殼質(zhì)等難降解有機(jī)物的功能酶，在堆肥后期有助于將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)前驅(qū)物，進(jìn)而促進(jìn)腐殖質(zhì)合成[49]。與WS 處理相比，在CS 和GW 處理中這兩種菌的豐度相對較高，促進(jìn)了木質(zhì)纖維素的降解（圖2e），有利于堆肥腐殖化。

圖4 不同高碳源輔料在堆肥過程細(xì)菌群落門水平的相對豐度和屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities at phylum and genus levels during composting of kitchen waste with different bulking agents

Pseudomonadota 的相對豐度隨著堆肥溫度降低逐漸升高（圖2a）。在堆肥開始階段，Pseudomonadota 的優(yōu)勢菌屬是不動桿菌屬（Acinetobacter）和腸桿菌（Enterobacter），可將油脂和蛋白質(zhì)作為呼吸作用的電子供體，將其分解利用[50]。隨著堆肥溫度的升高，這兩種厭氧發(fā)酵菌因?yàn)榫哂惺葻崦舾行?，致使相對豐度逐漸降低[51]。進(jìn)入降溫期后，Pseudomonadota 相對豐度開始增加，假單胞菌屬（Pseudomonas）和極小單胞菌（Pusillimonas）逐漸成為優(yōu)勢菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas對粗蛋白降解成氨基酸的促進(jìn)效果明顯，能夠聚合形成腐殖質(zhì)，促進(jìn)堆肥腐殖化[52]。相比于添加玉米秸稈和西瓜秧，園林廢棄物的添加使該菌屬更加豐富，致使GW 處理的蛋白質(zhì)含量在堆肥腐熟期迅速下降（圖2a），驅(qū)動氨基酸形成（圖3a），進(jìn)而促進(jìn)HA 了合成（圖3f）。

Bacteroidota 從堆肥降溫期開始逐漸富集，在腐熟期可占到總相對豐度的10%左右（圖4a）。有研究表明，Bacteroidota 屬于嗜溫菌，在堆肥降溫期能夠促進(jìn)腐殖質(zhì)前驅(qū)物的生成和難降解有機(jī)物的分解[53]。其中，莫氏桿菌（Moheibacter）和黃桿菌屬（Flavobacterium）是隸屬于該菌門的優(yōu)勢菌屬（圖4b），負(fù)責(zé)合成芳香化合物和降解含氧官能團(tuán)[54]。相比于其他處理，GW 處理中木質(zhì)素含量較高，促進(jìn)了優(yōu)勢菌群的富集，從而有著更高的Moheibacter和Flavobacterium的豐度，表明園林廢棄物對堆肥腐殖質(zhì)的芳香化促進(jìn)明顯，增加官能團(tuán)不飽和度。

2.5 細(xì)菌群落與腐殖化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

本研究進(jìn)一步使用網(wǎng)絡(luò)圖分析腐殖化指標(biāo)和細(xì)菌群落優(yōu)勢菌屬之間的相關(guān)性。如圖5 所示。

圖5 細(xì)菌群落和腐殖化相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。Fig.5 Relationships between bacterial communities and humification-related indicators.

堆肥過程中，F(xiàn)A、HA 及前驅(qū)物指標(biāo)與Bacillus、Thermobacillus等優(yōu)勢菌屬存在顯著相關(guān)性，表明這些優(yōu)勢菌屬對驅(qū)動腐殖化具有關(guān)鍵作用?？傮w來說，優(yōu)勢細(xì)菌屬與腐殖化指標(biāo)總體呈現(xiàn)正相關(guān)。在腐殖質(zhì)前驅(qū)物方面，氨基酸含量與Ureibacillus和Bacillus呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，這是因?yàn)檠挎邨U菌類細(xì)菌對大分子蛋白質(zhì)等含氮有機(jī)物的分解迅速[55]，其高豐度驅(qū)動CS 處理在堆肥高溫期的氨基酸含量增加迅速（圖3a）。另外，由于在HA的合成中氨基酸作為前驅(qū)物參與，因此HA 含量與其含量呈負(fù)相關(guān)。還原糖含量主要與Thermobacillus和Pseudogracilibacillus等高溫嗜熱菌呈顯著正相關(guān)，可能是由于這些細(xì)菌能夠促進(jìn)纖維素類有機(jī)質(zhì)的降解，從而增加還原糖含量。Oceanobacillus、Flavobacterium與多酚呈現(xiàn)正相關(guān)性，與以往的研究結(jié)論相同，主要是因?yàn)檫@些細(xì)菌對木質(zhì)纖維素的降解轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，從而導(dǎo)致多酚的產(chǎn)生（圖3e），并加強(qiáng)腐殖質(zhì)的芳構(gòu)化[56]。在堆肥高溫期，GW 處理和CS 處理中這些菌屬豐度明顯高于WS 處理，導(dǎo)致了還原糖濃度顯著上升（圖3d）。

在腐殖質(zhì)組分方面，F(xiàn)A 與Bacillus、Thermobacillus表現(xiàn)為顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，且HA 與FA 也呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)，可能是由于在堆肥過程中，這兩類菌屬可能是驅(qū)動FA 向HA 的轉(zhuǎn)化的主要微生物[45]。HA 與Moheibacter和Caldicoprobacter同樣呈現(xiàn)出正相關(guān)性，表明該菌屬能促進(jìn)HA 的形成。通過網(wǎng)絡(luò)分析，可以進(jìn)一步確認(rèn)，Thermobacillus、Bacillus、Flavobacterium等細(xì)菌是驅(qū)動堆肥過程有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)前驅(qū)物，進(jìn)而推動腐殖質(zhì)形成的關(guān)鍵細(xì)菌群落，對腐殖化具有重要調(diào)控作用。

2.6 細(xì)菌群落的功能預(yù)測

本研究進(jìn)一步采用FAPROTAX 數(shù)據(jù)庫對參與廚余垃圾堆肥過程有機(jī)物降解相關(guān)的細(xì)菌群落進(jìn)行了功能分析，用于揭示微生物對堆肥腐殖化的影響。廚余垃圾堆肥過程的C 循環(huán)功能主要為發(fā)酵和化能異養(yǎng)（圖6）。

堆肥初期占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌是具有芳香化降解功能的細(xì)菌，主要以Megasphaera和Lactobacillus為主，能夠降解酚類和芳香醇等芳香類物質(zhì)。隨著堆肥的進(jìn)行，C 循環(huán)的主要功能包括芳香化作用、好氧化能作用。這可能是由于堆肥進(jìn)入高溫階段，Thermobifida、Bacillus和Ureibacillus等具有可溶性有機(jī)物降解功能的細(xì)菌豐度增加，促進(jìn)了腐殖質(zhì)前驅(qū)物的大量增加。在堆肥結(jié)束時(shí)，C 循環(huán)的主要驅(qū)動因素是纖維素降解，尿素酶水解和木質(zhì)素降解。這種變化的主要原因是在堆肥后期Flavobacerium和Moheibacter的大量繁殖，使得木質(zhì)素和纖維素分解功能得到增強(qiáng)，促進(jìn)了氨基酸、多酚、還原糖等形成腐殖質(zhì)。

相比于添加西瓜秧和園林廢棄物，添加秸稈能夠提高與芳香族化合物降解有關(guān)的微生物豐度，促進(jìn)木質(zhì)纖維素降解。同時(shí)，在GW 和CS 處理中，具有木聚糖降解、纖維素降解功能的菌群相對豐度也明顯大于WS 處理，主要由于園林廢棄物和玉米秸稈中較高的纖維素和半纖維素含量，促進(jìn)了菌群的富集[57]。隨著堆肥進(jìn)行到第16 天，與其他兩個(gè)處理相比，CS 處理中具有纖維素降解、木聚糖降解功能的細(xì)菌豐度明顯更高。這也表明了玉米秸稈添加對堆肥過程木質(zhì)纖維素的降解有促進(jìn)作用，并且玉米秸稈相較于其他兩種輔料更能促進(jìn)堆體快速升溫，從而加速有機(jī)質(zhì)的降解，促進(jìn)腐殖化進(jìn)程。

3 結(jié)論

1）園林廢棄物、玉米秸稈和西瓜秧作為輔料，均能有效改善廚余垃圾堆肥性能。與西瓜秧和園林廢棄物作為輔料相比，添加15%的玉米秸稈能夠保障廚余垃圾堆肥快速升溫，高溫期可維持10 d；西瓜秧具有較高蛋白含量，將其作為輔料能夠在堆肥初期促進(jìn)快速升溫，但相比于園林廢棄物和玉米秸稈輔料其高溫期較短。

2）玉米秸稈作為對多酚、氨基酸和還原糖等腐殖質(zhì)前驅(qū)物的生成有促進(jìn)作用，保障堆肥腐熟和有機(jī)質(zhì)腐殖化，堆體種子發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）在堆肥結(jié)束時(shí)提升至130%；園林廢棄物有較高的木質(zhì)素含量，有利于堆肥過程的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和腐殖質(zhì)的不飽和官能團(tuán)生成。

3）相關(guān)性分析表明，玉米秸稈添加能夠富集Oceanobacillus、Thermobacillus、Flavobacterium、Bacillus和Moheibacter等具有纖維素降解、芳香化合物降解和纖維素降解功能的細(xì)菌，有助于有機(jī)質(zhì)降解有助于有機(jī)質(zhì)降解和腐殖質(zhì)合成。