劉麗莉，于 影，蘇克楠，張瀟丹，程偉偉，賀家亮

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心，食品加工與質(zhì)量安全控制河南省國際聯(lián)合實驗室，洛陽 471023）

0 引言

牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）是牛血清中含量最多的蛋白質(zhì)，氨基酸種類豐富、組成平衡。BSA 是一種球狀可溶性蛋白，已廣泛應(yīng)用于生化工程，由于環(huán)境條件變化、食品加工處理，其結(jié)構(gòu)和功能特性會受到影響[1]。

植物資源中獲得的酚類化合物可以作為金屬離子螯合劑、氫供體、單線態(tài)氧猝滅劑或還原劑，通常可作為添加物改善食品的品質(zhì)[2]。植物多酚獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化[3]、抑菌[4]、抑制酶活性[5]等功能。多酚類化合物中豐富的酚羥基可通過靜電、氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵結(jié)合蛋白質(zhì)[6]。多酚-蛋白質(zhì)相互作用影響蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能特性形成復(fù)合物[7]，這些作用可以使蛋白質(zhì)在處理和儲存時更加穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的品質(zhì)和保質(zhì)期。

國內(nèi)外近年進(jìn)行的有關(guān)多酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究，主要集中在蛋白結(jié)構(gòu)、互作機制、功能特性[8]等方面，如MENG 等[9]發(fā)現(xiàn)綠原酸和乳清蛋白分離物非共價結(jié)合導(dǎo)致蛋白的二級結(jié)構(gòu)改變，ɑ-螺旋和β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變；王振國等[10]研究大豆分離蛋白與葡萄籽原花青素的相互作用，復(fù)合物的溶解度、乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)、ζ-電位絕對值及持水性均顯著提高。對多酚與BSA 相互作用的研究涉及多種多酚類化合物，主要包括類黃酮、花青素等，如LIANG 等[11]研究了BSA 與三鹵苯酚的相互作用。MIHAELA 等[12]采用熒光猝滅法和分子對接探討了pH 值為7.5 和298 K 條件下BSA 與不同多酚的相互作用，發(fā)現(xiàn)不同種類多酚如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、黃酮（flavonoids）和羥基肉桂酸（p-hydroxy cinnamic acid）等對蛋白影響不同，其中EGCG 影響較大。LIU等[13]研究了乳清分離蛋白（whey protein isolation，WPI）分別與4 種多酚EGCG、槲皮素（quercetin，QC）、芹菜素（apigenin，AG）、柚皮素（naringenin，NG）的相互作用，WPI-EGCG 結(jié)構(gòu)變化最明顯且具有最好的抗氧化性能和熱穩(wěn)定性。ANITHA 等[14]通過紫外-可見吸收和熒光光譜研究了兒茶素和表兒茶素與牛血清白蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)兩種多酚在單個結(jié)合位點都表現(xiàn)出與BSA 的強烈相互作用，多酚-BSA 復(fù)合物具有更致密的結(jié)構(gòu)。YU 等[15]發(fā)現(xiàn)茶黃素-3，3'-二甲酸酯（theaflavin 3,3′-digallate，TFDG）與BSA 相互作用屬于靜態(tài)淬滅，互作后BSA 周圍的微環(huán)境疏水性更強，α-螺旋增加，結(jié)構(gòu)緊密，疏水相互作用和氫鍵主導(dǎo)TFDG 與BSA 之間的相互作用。ZHANG 等[16]研究了谷蛋白（glutenin，Glu）/麥醇溶蛋白（GLIADIN，Gli）與綠原酸（chlorogenic acid，CA）/木犀草素（luteolin，LU）的相互作用機制，及其對Glu/Gli 結(jié)構(gòu)和CA/LU 抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)CA/LU 的相互作用機制和對Glu/Gli 結(jié)構(gòu)的影響存在顯著差異。綜上所述，不同的多酚和蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能影響不同，并且不同的植物多酚與BSA 之間的相互作用及對BSA 結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。

因此，本研究選擇4 種不同的植物多酚：原花青素（proanthocyanidins，PC）是兒茶素或表兒茶素的聚合體，是目前國際公認(rèn)的清除機體自由基最有效的天然抗氧化劑[17]，其性質(zhì)受產(chǎn)地的影響；兒茶素（catechin，C）是茶多酚抑菌的主要有效成分，屬于黃烷醇類物質(zhì)[18]；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶表兒茶素類含量最高的一個單體成分，占兒茶素的50%～70%，具有有效成分明確、活性更強等優(yōu)點[19]；茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，被證實是一種有效的抗菌物質(zhì)[20]。通過紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜、分子對接等多種方法研究PC、C、EGCG、TP 與BSA 的相互作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，探究不同多酚對BSA 相互作用和對BSA 結(jié)構(gòu)的影響，篩選出最穩(wěn)定的植物多酚-BSA 復(fù)合物，以期為植物多酚和BSA 的高值化利用、產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)，擴展植物多酚與蛋白質(zhì)的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（BSA，純度＞97%）購自上海譜振生物科技有限公司；原花青素（PC，純度＞98%）產(chǎn)地為河南省鄭州市，來源于葡萄籽提取物；兒茶素（C，純度＞97%）由產(chǎn)自安徽的茶葉中提?。槐頉]食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度＞95%）是從福建綠茶中分離得到的兒茶素類單體；茶多酚（TP，純度＞98%）福建綠茶多酚提取物；多酚購自天津德恩試劑有限公司；0.05 mol/L pH 6.8 的Tris-HCl 溶液為河南科技大學(xué)食品學(xué)院實驗室配制。其他試劑均為分析純級。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子分析天平(BBA124S)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(752N)，北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司；低速中等容量離心機（TD5Z），金壇區(qū)金城春蘭實驗儀器廠；旋渦混合儀（XH-B），無錫杰瑞安儀器有限公司；紫外可見分光光度計石英比色皿，宜興市譜析光學(xué)元件廠；熒光分光光度計(Cary eclipse 型），美國Aglient 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum 10 型），上海鉑金埃爾默儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（JSM-7500F 型），富瑞博國際有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫外可見光譜測定多酚-BSA 相互作用

參考ZANG 等[21]的方法并改進(jìn)，用Tris-Hcl 緩沖液和BSA 粉末配制濃度為1.0×10-5mol/L BSA 溶液。將BSA 溶液和等量不同濃 度1×10-5、5×10-5、1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4mol/L 的PC、C、EGCG、TP，充分混勻，在290 K 分別反應(yīng)30 min。以不加多酚的BSA 和不加BSA 的多酚為對照組，將待測樣品倒入1 cm 比色皿中。掃描波長：200～450 nm。

1.3.2 熒光光譜測定多酚-BSA 相互作用

按照上文的方法制備2 組樣品溶液，上述樣品分別在290 和300 K 條件下反應(yīng)。根據(jù)熊喆等[22]的方法改進(jìn)，測定條件為：激發(fā)波長（280 nm），激發(fā)和發(fā)射狹縫（10 nm），掃描范圍（300～450 nm）。

為了更好地解釋4 種多酚與BSA 結(jié)合的猝滅類型，采用Stern-Volmer 方程計算[23]：

式中Kq、Ksv、τ0和Cq分別代表熒光猝滅速率常數(shù)（L/mol）、動態(tài)猝滅常數(shù)（L/ mol）、不存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的平均壽命和多酚的濃度（mol/L），F(xiàn)0為不加多酚時BSA 的熒光強度，F(xiàn)為加入多酚后的熒光強度。

多酚與蛋白質(zhì)相互作用過程中結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可以通過式（2）計算[24]。

其中Q為多酚的濃度，mol/L；KA為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)。

1.3.3 傅里葉紅外光譜測定多酚-BSA 相互作用

根據(jù)江連洲等[25]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，將1.0×10-5mol/L 的BSA 溶液和2.0×10-4mol/L 多酚溶液各2 mL混合后用Tris-Hcl 緩沖液定容至10 mL，在290 K 溫度下，避光磁力攪拌，反應(yīng)30 min。進(jìn)行冷凍干燥后，將1 mg 的BSA 和多酚-BSA 樣品分別與99 mg 溴化鉀混合磨粉并壓制成片。利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行全波段掃描，設(shè)置掃描次數(shù)為32，測量波數(shù)4 000～500 cm-1，分辦率4 cm-1。

1.3.4 分子對接模擬

參考王曉霞等[26]的方法，從PBD 數(shù)據(jù)庫下載BSA分子構(gòu)象，采用DFT 算法進(jìn)行能量優(yōu)化，使用Gaussian 09W 軟件對BSA 進(jìn)行能量最優(yōu)化處理。利用PubChem數(shù)據(jù)庫查找多酚的分子構(gòu)像。打開AutoDockTools-1.5.6，分別讀取大小分子，進(jìn)行相應(yīng)的去水、加氫和加電荷。正式對接（Docking）采用遺傳算法(genetic algorithm，GA)，對接次數(shù)為100 次，通過AutoDock Vina 對接后的結(jié)果，篩選出最優(yōu)簇中結(jié)合能最低的構(gòu)象并記錄對接后的結(jié)合能。確定4 種多酚與BSA 結(jié)合最佳的構(gòu)象，用PyMOLWin 打開進(jìn)行氫鍵標(biāo)出和構(gòu)象的修飾，最后保存修飾結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗測定結(jié)果均做3 次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)利用Origin 2021 軟件繪圖，用DPS 軟件進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。使用AutoDockTools-1.5.6 軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外可見光譜分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA結(jié)構(gòu)變化

如圖1 所示，與多酚和BSA 對照組的紫外圖譜比較，多酚-BSA 紫外吸收峰的位置和強度均發(fā)生了變化，說明二者相互作用產(chǎn)生了新的復(fù)合物。隨著PC、C、EGCG、TP 添加量的增加，BSA 在286 nm 的最大吸收峰都呈現(xiàn)上升的趨勢且發(fā)生紅移?？赡苡捎诙喾雍偷鞍踪|(zhì)大分子的堿基對π 電子結(jié)合，多酚的π＊空軌道與堿基對的π 軌道偶合，使能量降低，導(dǎo)致π→π＊躍遷能量降低。紅移波長由大到小為EGCG（292 nm）、PC（288 nm）、C（288 nm）、TP（288 nm），說明EGCG 與BSA 的相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響最大。這可能由于EGCG 是單體多酚，較易進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的疏水氨基酸殘基中并通過疏水相互作用結(jié)合形成疏水腔，從而導(dǎo)致EGCG-BSA吸收峰的紅移最明顯。任紅濤等[6]發(fā)現(xiàn)花生致敏蛋白與咖啡酸相互作用后紫外吸收藍(lán)移，與本研究結(jié)果相反，這是由于咖啡酸的助色團或發(fā)色團使得花生致敏蛋白多肽鏈伸展而發(fā)生藍(lán)移。

圖1 PC、C、EGCG、TP 與BSA 結(jié)合的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of PC,C,EGCG,TP combined with BSA

2.2 熒光光譜分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA 結(jié)構(gòu)變化

熒光光譜可用來表征蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)熒光光譜最大發(fā)射波長發(fā)生紅移或者藍(lán)移，說明氨基酸殘基周圍微環(huán)境改變，極性增強[27]。PC、C、EGCG、TP與BSA 結(jié)合的熒光光譜圖如圖2 所示，隨著4 種多酚濃度增加，BSA 熒光強度逐漸下降，說明多酚與BSA 均發(fā)生了相互作用，使得更多的酪氨酸或色氨酸熒光猝滅，最終導(dǎo)致熒光強度降低。熒光強度的降低，表明兩個分子形成了復(fù)合物[28]。4 種多酚最大波長紅移由大到小為EGCG、PC、C、TP（365 nm、364 nm、364 nm、363 nm），說明EGCG使BSA 的微環(huán)境變化最大，可能由于EGCG 的結(jié)構(gòu)中含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，鄰苯二酚結(jié)構(gòu)具有較強的氫鍵相互作用力和較強的親水性，能與BSA相互作用形成疏水性較低的復(fù)合物，從而導(dǎo)致EGCG 與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光光譜出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象。這與紫外可見光吸收光譜的研究結(jié)果一致。ZHANG 等[29]研究槲皮素與大豆分離蛋白相互作用，與本試驗結(jié)果不相符，可能是形成的槲皮素-大豆分離蛋白復(fù)合物疏水性較強，造成熒光最大波長藍(lán)移。

圖2 PC、C、EGCG、TP 與BSA 結(jié)合的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of four polyphenols PC、C、EGCG、TP combined with BSA

2.2.1 猝滅類型的確定

圖3 展示了以F0/F為y軸，對Cq（0～2.0×10-4mol/L）做線性回歸方程的結(jié)果。由于不存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的平均壽命為10-8s，可以通過回歸方程的斜率求出Kq、Ksv，見表1。通過表1 可知，反應(yīng)溫度升高時Ksv值呈現(xiàn)下降的趨勢，說明4 種多酚對BSA 的猝滅機制可能是靜態(tài)猝滅。與CEYLAN 等[30]對脫酚榛子粉蛋白分離物和榛子皮酚類提取物的研究結(jié)果類似。在290、300 K 溫度下[31]，多酚對蛋白質(zhì)的猝滅速率常數(shù)數(shù)量級為1013，超過了動態(tài)猝滅常數(shù)的最大值，證明4 種多酚對BSA 的猝滅類型均是靜態(tài)猝滅。溫度升高時，復(fù)合物的Ksv減小。其中EGCG-BSA 的Ksv減小最明顯，說明EGCG-BSA 受溫度影響較大，EGCG 分子中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)在高溫下可能會發(fā)生斷裂或變形，從而導(dǎo)致其與BSA 結(jié)合的相互作用力發(fā)生減弱，導(dǎo)致熒光猝滅常數(shù)減小明顯。

表1 不同溫度下PC、C、EGCG、TP 與BSA 相互作用的動態(tài)猝滅常數(shù)、熒光猝滅速率常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants and bimolecular quenching rate constants for the interaction of PC、C、EGCG、TP with BSA at various temperatures

圖3 PC、C、EGCG、TP 與BSA 相互作用的Stern-Volmer 圖Fig.3 Stern-Volmer diagram of PC、C、EGCG、TP interacting with BSA

2.2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的確定

根據(jù)式（2），對lg(F0-F)/F和lgQ作雙對數(shù)圖，如圖4 所示。通過線性回歸方程擬合，得到多酚與BSA 的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，其結(jié)果見表2。由表2 可知，結(jié)合常數(shù)KA與猝滅常數(shù)Ksv隨溫度變化的規(guī)律相同，溫度越高，結(jié)合常數(shù)KA越小，均為103級，證明4 種多酚與BSA 存在較弱的相互作用力。這與文獻(xiàn)中對幾種多酚配體和BSA 結(jié)合的研究結(jié)果類似[7]。4 個相互作用體系的結(jié)合位點數(shù)n都接近于1，說明4 種多酚與BSA 分別在一個位點發(fā)生結(jié)合。劉玉茜等[32]研究表兒茶素分子與鐵蛋白的結(jié)合位點數(shù)n=98.5，與本試驗結(jié)果不符合，原因可能是不同蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致結(jié)合位點數(shù)存在差異。

表2 不同溫度下（290 K、300 K）PC、C、EGCG、TP 與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 2 Binding constants and number of binding sites for interaction between PC、C、EGCG、TP and BSA at different temperatures (290 K,300 K)

圖4 不同溫度下四種多酚與BSA 相互作用lg(F0-F)/F 對lgQ的關(guān)系曲線圖Fig.4 Relationship between lg(F0-F)/F and lgQ between four polyphenols and BSA at different temperatures

2.3 紅外光譜分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA 結(jié)構(gòu)變化

酰胺I 帶(1 600～1 700 cm-1）對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的改變比酰胺II 帶更為敏感[33]，因此常被用來解析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。如圖5 所示，BSA 與4 種多酚結(jié)合后，酰胺Ⅰ帶吸收峰（1 657.44 cm-1）發(fā)生藍(lán)移，說明氫鍵參與了相互作用。藍(lán)移程度由大到小為PC（1 656.15 cm-1）、TP（1 632.07 cm-1）、EGCG（1 631.49 cm-1）、C（1 631.44 cm-1），說明PC 與BSA 結(jié)合產(chǎn)生的氫鍵最多?？赡苡捎赑C 分子中含有更多的羥基官能團，因此在BSA 分子中更容易形成氫鍵相互作用，影響B(tài)SA 的二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酰胺I 帶發(fā)生更大程度的藍(lán)移。這與王然等[34]通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)茶多酚-淀粉酯納米顆粒之間存在氫鍵和疏水相互作用的研究結(jié)果類似。

圖5 PC、C、EGCG、TP 與BSA 復(fù)合物的的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectra of PC、C、EGCG、TP with BSA complexes

表3 為BSA 及多酚-BSA 復(fù)合物的酰胺I 帶二級結(jié)構(gòu)組成比例。與BSA 比較，復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)中各組成的含量發(fā)生了顯著變化。添加TP、PC、C 之后，BSA 二級結(jié)構(gòu)由β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊、ɑ-螺旋，β-折疊、ɑ-螺旋相對含量的增加，表明TP、PC、C 增強BSA 構(gòu)象的致密性。DAI[35]等發(fā)現(xiàn)兒茶素與大豆蛋白相互作用后，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變得松散無序，與本研究結(jié)果不同，可能是與兒茶素的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)被打開，形成不穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)。氫鍵是維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的主體力量，α-螺旋的增加說明多酚-BSA 疏水區(qū)域內(nèi)有新的氫鍵形成。β-折疊含量呈現(xiàn)增加的趨勢，這與蛋白質(zhì)疏水性區(qū)域變緊密后蛋白質(zhì)位點減少有關(guān)，其中C-BSA（40.20%）、PC-BSA（39.50%）、EGCG-BSA（39.32%）、TP-BSA（34.04%），證明C 更能促進(jìn)BSA 的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可能由于C 豐富的羥基（-OH）可與蛋白質(zhì)中的帶氧或氮原子的基團形成氫鍵，氫鍵可以增強蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使其結(jié)構(gòu)變得更加緊密[36-37]。

表3 PC、C、EGCG、TP 與BSA 互作后酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)組成比例Table 3 Proportion of secondary structure of amide I band after PC、C、EGCG、TP interact with BSA

2.4 分子對接

分子對接可以彌補光譜法的不足，更直觀、充分地認(rèn)識小分子與大分子間的結(jié)合特性[38]。圖6 為多酚PC、C、EGCG、TP 與BSA 的分子對接圖。

圖6 PC、C、EGCG、TP 與BSA 分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of PC,C,EGCG,TP and BSA

分子對接結(jié)果顯示，4 種多酚與BSA 的相互作用位點位于蛋白質(zhì)分子的Sub-domain IIA 疏水腔中。ZHANG等[39]利用藜蘆醇和姜黃素與β-乳球蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)合方式和位點與本試驗不相符，參與相互作用的原子和空間結(jié)構(gòu)互補的位置不同，導(dǎo)致對接結(jié)果不同。PC與BSA 的Gln-416、Lys-533、Ala-500 殘基相鄰，之間距離分別為2.6 ?、2.5 ?和2.6 ?，分子間主要存在氫鍵相互作用力。C 與BSA 的Thr-305、Pro-303、Arg-336等殘基相鄰，并存在氫鍵相互作用力，又與Leu-301 疏水性殘基相鄰，表明它們之間存在疏水相互作用力，距離分別為2.6 ?、3.4 ?、2.0 ?以及2.1 ?。C 與BSA 形成疏水作用力為主、氫鍵相互作用為輔的結(jié)合模式，形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。EGCG 和BSA 的Lys-116、Tyr-160、Glu-125 等殘基相鄰，之間距離分別為2.1 ?、2.2 ?以及2.5 ?，BSA 的Tyr-160 殘基與EGCG 之間存在π-π 相互作用，這一發(fā)現(xiàn)解釋了EGCG 會導(dǎo)致BSA 熒光的猝滅。一般情況下，鍵長越接近2.5 ?則氫鍵作用力越強。氨基酸Glu-125 與EGCG 間的鍵長較接近2.5 ?，即Glu-125與EGCG 結(jié)合時產(chǎn)生了較強的氫鍵作用。TP 和BSA 的Glu-564、Ala-510 殘基相鄰，距離分別為3.2 ?、2.3 ?，存在氫鍵作用及疏水相互作用。與ZANG 等[40]對藍(lán)莓花青素（ANs）和乳清分離蛋白（WPI）通過氫鍵和疏水力相互作用的研究結(jié)果一致。4 種多酚的結(jié)合能C、EGCG、PC、TP（-3.72 kJ/mol、-1.77 kJ/mol＜-1.02 kJ/mol、-0.38 kJ/mol），C-BSA 表現(xiàn)出最好的結(jié)合能力，可能是由于C 的苯環(huán)具有疏水性，能與蛋白質(zhì)的疏水腔緊密結(jié)合，EGCG 則由于氫鍵對接位點多，能與BSA 穩(wěn)定結(jié)合。分子對接結(jié)果進(jìn)一步支撐上述光譜試驗結(jié)果。

3 結(jié)論

本文通過紫外光譜法、熒光光譜法、紅外光譜法和分子對接等技術(shù)探討了4 種植物多酚與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用及結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)論如下：

1）隨著多酚濃度增加，286 nm 處的紫外吸收峰明顯增大并且發(fā)生紅移表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、原花青素（proanthocyanidins，PC）、兒茶素（catechin，C）、茶多酚（tea polyphenol，TP），多酚與BSA 相互作用產(chǎn)生了新的復(fù)合物，其中EGCG 與BSA 的相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響最大。

2）通過熒光光譜分析，4 種多酚引起B(yǎng)SA 的猝滅現(xiàn)象是動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅共同作用的結(jié)果，結(jié)合位點大致相同，結(jié)合位點數(shù)n接近于1，說明多酚與蛋白質(zhì)之間只存在一個結(jié)合位點。

3）多酚能促進(jìn)BSA 的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使BSA 酰胺Ⅰ帶的吸收峰發(fā)生藍(lán)移PC、TP、EGCG、C，其中PC與BSA 結(jié)合產(chǎn)生的氫鍵最多；酰胺II 帶峰形變寬，說明有新的氫鍵產(chǎn)生；BSA 二級結(jié)構(gòu)由β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊、ɑ-螺旋，β-折疊含量呈現(xiàn)增加的趨勢CBSA、PC-BSA、EGCG-BSA、TP-BSA，表明C 更能促進(jìn)BSA 的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

4）分子對接進(jìn)行驗證發(fā)現(xiàn)，結(jié)合位點位于Subdomain IIA 的疏水腔中，分子間相互作用力主要是氫鍵、疏水作用力，結(jié)合能C 和EGCG 最小，形成的復(fù)合物最穩(wěn)定。

研究結(jié)果表明，4 種植物多酚能與BSA 相互作用，多酚的加入使得BSA 的結(jié)構(gòu)更加緊密和穩(wěn)定，其中C、EGCG 與BSA 相互作用的程度最大、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。該研究可為植物多酚與BSA 相互作用機理分析及開發(fā)多組分共存的復(fù)合物提供參考。