丁國偉,李甜甜,徐 萍,魏榮榮,李 琛,王設(shè)市,潘 晨,范 娟

(揚(yáng)州市揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司,江蘇揚(yáng)州 225008)

豬瘟是一種由豬瘟病毒感染引起的傳染病,給全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。豬瘟病毒主要編碼12種蛋白,其中病毒增殖所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白之一就是NS3蛋白[2-3],且該蛋白高度保守。機(jī)體感染豬瘟病毒后可檢測到NS3抗體[4]。豬瘟病毒感染豬后引起發(fā)熱,體溫升高,出血壞死等典型癥狀[5],具有非常高的發(fā)病率,混合感染引起的死亡率也很高。屬于1類傳染病,目前尚缺乏很好的治療方法,一旦發(fā)病立即采取撲殺措施,是養(yǎng)豬業(yè)所面臨的難題[6]。

NS3蛋白是由NS2-3蛋白進(jìn)一步加工而成,其編碼基因長達(dá)2 049 bp,具有多種酶活性,該蛋白功能比較多[7]。并且NS3的生物學(xué)特征和基因序列在不同毒株之間沒有顯著差異。大量研究證明,該蛋白免疫活性高,可以刺激機(jī)體使機(jī)體產(chǎn)生高水平的針對該蛋白的特異性抗體。由于NS3所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的保護(hù)性未得到驗(yàn)證,因此,雖然不適合用于制備疫苗,但是可以通過檢測NS3的抗體來對豬瘟進(jìn)行診斷。因此,在CSFV的檢測與診斷方面,研制抗NS3蛋白的診斷試劑盒將受到關(guān)注。筆者使用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a對NS3的基因片段進(jìn)行了分割連接,然后進(jìn)行表達(dá)和純化,獲得具有免疫活性的截短蛋白,為今后豬瘟病毒的鑒別診斷等提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體該研究使用的經(jīng)典豬瘟毒株為經(jīng)典C株,表達(dá)載體為pET-28a,表達(dá)菌株為BL21(DE3),均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑分子生物學(xué)試劑主要有:2×TaqMaster Mix、DEPC(焦碳酸乙二酯)、T4連接酶、Trizol LS resgent(Invitrogen)、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix、HindIII、BamHI、SalI和DNA Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit、PCR clean up kit、IPTG、RNaseA和X-gal等。

1.3 方法

1.3.1病毒cDNA的獲得。通過Trizol方法提取豬瘟病毒RNA,并根據(jù)北京全式金生物技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,并在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2NS3全基因測序分析。參考GenBank中比對CSFV的NS3全基因序列,設(shè)計(jì)1對引物NS3-F、NS3 -R;將cDNA送至生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。然后用DNAStar軟件中的Protean分析NS3蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、可塑性和抗原表位進(jìn)行分析[8]。

1.3.3引物設(shè)計(jì)與合成及目的基因的獲得。在分析CSFV C株的NS3基因及蛋白序列后,截獲第1段,即a段第1～212位氨基酸、b段第189～389位氨基酸以及c段第390～591位氨基酸;并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物NS3a-F/R、NS3b-F/R和NS3c-F/R,在起始端加上BamH I酶切位點(diǎn),在終止端加上Sal I酶切位點(diǎn),送至生物公司進(jìn)行合成,引物使用濃度為20 μmol/L,于-20 ℃凍存?zhèn)溆?上述引物可以分別擴(kuò)增出a、b、c 3段基因片段,a段位于1～212位氨基酸,b段位于189～389位氨基酸,c段位于390～591位氨基酸,大小分別為645、609和615 bp(圖1)。a、b、c 3段基因引物設(shè)計(jì)為NS3a-F:CGCGGATCCATGGGCAGGGGGCCCGCTGTTTG;NS3a-R:ACGCGTCGACTTACTTCACCATCTCCGTCAAGTCCGTG;NS3b-F:CGCGGATCCATGGGCAAACCAACCAAGCTCATG;NS3b-R:ACGC-GTCGACTTAGGCAATGTCCAAGTAATCTGAACCTAAG;NS3c-F:CGCGGATCCATGGGCGGACTGAAGATACCAGTAG;NS3c-R:ACGCGTCGACTTACATTATATTTTTTACTGCTACCGGCAAC。

圖1 NS3氨基酸分析與截取Fig.1 NS3 amino acid analysis and interception

1.3.4DNA片段的純化回收及連接轉(zhuǎn)化。 將目的條帶切膠后進(jìn)行回收純化,純化后測定濃度并建立20 μL的雙酶切體系,將目的基因與pET-28a用BamH I和Sal I分別于37 ℃酶切2～3 h;限制酶消化后,按照Axygen試劑盒的說明書純化;然后建立20 μL連接體系進(jìn)行4 ℃過夜連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中,并且靜置培養(yǎng)后,挑取陽性菌落培養(yǎng)并用于PCR鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定和測序用小提質(zhì)粒試劑盒提取pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質(zhì)粒。通過PCR鑒定上述重組質(zhì)粒,并通過測序進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.5 重組蛋白的表達(dá)及純化

1.5.1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。將鑒定及測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株,用終濃度為1.0 mmol/L IPTG,37 ℃ 220 r/min搖床誘導(dǎo)表達(dá)4 h,同時(shí),設(shè)置空載體對照組。通過離心收集細(xì)胞,重懸,并通過超聲波裂解儀裂解5 min,并離心5 min取上清液,用于蛋白質(zhì)電泳分析。

1.5.2NS3b目的蛋白的大量表達(dá)及純化。將10 mL母液加入800 mL 抗Kana LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)5 h或過夜表達(dá),離心收集菌體,對表達(dá)的重組蛋白CSFV-His-NS3b參照HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱說明書進(jìn)行Ni柱純化,具體方法如下:①用Ni柱上樣緩沖液將菌體洗2次,100 mL 重懸,超聲波裂解儀裂解10 min,懸液變得清透,蛋白可溶,離心并收集上清液;②用0.45 μm濾器將上述收集的上清進(jìn)行過濾除雜;③用超純水清洗Ni柱后,用Ni柱上樣緩沖液平衡Ni柱;④上樣,并收集樣品備用;⑤上樣完成后用Ni柱上樣平衡緩沖液進(jìn)行平衡,而后用含10 mmol/L咪唑除雜液進(jìn)行除雜,每步留樣備用;⑥最后用洗脫液洗脫Ni柱結(jié)合的蛋白,收集保存樣品;⑦洗脫后用Ni柱上樣緩沖液平衡Ni柱,之后以0.01 mol/L NaOH洗柱,再以 20%乙醇過柱,4 ℃保存。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒及ELISA 2種方法,測得蛋白濃度約為5 mg/mL。

1.6 免疫原的分析鑒定

1.6.1SDS-PAGE分析鑒定。SDS-PAGE電泳前蛋白預(yù)處理:取40 μL純化后的CSFV-His-NS3重組蛋白加入10 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液,混勻,金屬浴95 ℃ 7 min,冰浴5 min,12 000 r/min離心5 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE電泳:將2玻璃板固定于加樣器上;按照試劑盒A盒配制12%分離膠5 mL;20 min后棄去超純水并用濾紙吸凈;再按照B盒說明書配制5%濃縮膠2 mL;將濃縮膠加入玻璃板中,迅速準(zhǔn)確插入梳子,固化30 min;然后拔出梳子,每孔加入10 μL樣品。在開始時(shí)以240 V電壓跑膠30 min,直到溴酚藍(lán)距下緣0.5 cm時(shí)停止電泳。膠塊切2塊,一塊用于Western-blot鑒定,另一塊用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色,水平搖床染色30 min,而后脫色搖床脫色觀察并拍照。

1.6.2Western-blot分析鑒定。SDS-PAGE電泳后的凝膠用去離子水沖洗1次,切割硝酸纖維素膜和濾紙,其大小與膠塊相同,浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中5 min;轉(zhuǎn)印裝置安裝順序按黑色面板為負(fù)極,白色面板為正極放入,標(biāo)記硝酸纖維素薄膜的正負(fù)極,玻璃棒除去各層之間的殘留氣泡,并在轉(zhuǎn)移裝置中以240 V轉(zhuǎn)移1.5 h。

轉(zhuǎn)移結(jié)束后,通過預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記觀察效果,洗滌后封閉2 h;一抗采用豬陽性血清,4 ℃過夜;二抗采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的小鼠抗豬IgG(1∶2 000稀釋),37 ℃搖床100 r/min,2 h;最后以新鮮的TMB著色溶液,在避光的環(huán)境下進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS3基因測序通過測序測得NS3基因?yàn)? 046 bp大小,與理論大小一致。

2.2 NS3蛋白分析結(jié)果

2.2.1NS3二級結(jié)構(gòu)。

2.2.1.1NS3全蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)。NS3全蛋白1～682的α螺旋結(jié)構(gòu)在3～25、45～49、96～102、122～125、130～137、205～215、240～249、256～268、276～292、306～347、365～403、469～480、489～496、498～503、530～536、559～595、632～642、647～659和671～682位氨基酸殘基,共285個(gè)氨基酸,共占整個(gè)序列42%。其中,a段1～212位氨基酸,α螺旋結(jié)構(gòu)在5～29、47～51、98～104、132～139、154～164和207～215,共65個(gè)氨基酸,共占30%;b段189～389位氨基酸,α螺旋結(jié)構(gòu)在19～29、54～63、70～82、90～106、120～161和179～204,共119個(gè)氨基酸,共占58%;c段390～591位氨基酸,α螺旋結(jié)構(gòu)在7～16、2～34、82～93、102～109、111～116、143～149和172～205,共92個(gè)氨基酸,共占44%。

2.2.1.2NS3全蛋白β折疊結(jié)構(gòu)。NS3全蛋白的β折疊結(jié)構(gòu)在37～44、58～61、65～73、77～91、114～121、124～126、142～147、176～184、193～202、210～217、222～229、250～256、262～269、292～296、301～305、346～352、356～362、402～407、437～444、446～455、456～468、484～489、493～499、508～513、536～553、609～617、669～673和678～682位氨基酸殘基,共218個(gè)氨基酸,占該段氨基酸序列32.0%。a段β折疊結(jié)構(gòu)在39～46、60～63、67～75、79～93、116～123、126～128、144～149、178～186和195～204,共72個(gè)氨基酸,占該段序列34%;b段β折疊結(jié)構(gòu)在6～16、24～31、36～43、64～70、76～83、106～110、115～119、160～166和170～176,共66個(gè)氨基酸,共占32.4%;c段β折疊結(jié)構(gòu)在15～20、50～57、59～68、69～81、97～102、106～112、121～126和149～166,共74個(gè)氨基酸,占該段氨基酸序列36.1%。

2.2.1.3NS3全蛋白β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。NS3全蛋白β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)共224個(gè)氨基酸,分布較均勻緊湊,共占整個(gè)氨基酸序列32.8%。a段β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),共92個(gè)氨基酸,占該段序列42.8%;b段β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)共48個(gè)氨基酸,占該段序列32.4%;c段β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)共72個(gè)氨基酸,占該段序列35.1%。

2.2.1.4NS3全蛋白無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。NS3全蛋白無規(guī)則卷曲在30～31、34～36、53～55、94～97、128～129、150～151、172～173、203～204、218～220、229～232、271～173、305～306、353～354、362～366、434～435、595～597、618～621、663～666和668～670,共55個(gè)氨基酸,共占整個(gè)氨基酸序列8.1%。a段20位氨基酸,占該段序列9.3%;b段22位氨基酸,占該段序列10.8%;c段5位氨基酸,占該段序列2.4%。

2.2.2NS3蛋白親水性。NS3全蛋白親水性結(jié)構(gòu)在501～506、512～521、527～570、605～609、624～629和649～652位氨基酸殘基,共34個(gè)氨基酸,共占整個(gè)序列5%。a段親水結(jié)構(gòu)共116個(gè)氨基酸,占該段序列54.5%;b段親水結(jié)構(gòu)共103個(gè)氨基酸,占該段序列51%;c段親水結(jié)構(gòu)共104個(gè)氨基酸,占該段序列51.3%。

2.2.3NS3蛋白表面可及性。NS3全蛋白表面可及性結(jié)構(gòu)在9～15、32～38、92～100、183、191、233～237、266、272、305～308、361～366、396～399、415～436、501～507、512～521、527～530、605～609、624～629和649～652位氨基酸殘基,共102個(gè)氨基酸,共占整個(gè)序列15%。a段表面可及性在11～16、35～39、94～102和185～193,共29個(gè)氨基酸,占該段氨基酸序列13.5%;b段表面可及性在2～6、47～51、59～63、80～86、119～122和176～181,共32個(gè)氨基酸,占該段氨基酸序列15.7%;c段表面可及性在44～49、114～120、125～135、140～143和166～177,共33個(gè)氨基酸,占該段氨基酸序列16.1%。

2.2.4NS3蛋白可塑性。NS3全蛋白可塑性區(qū)域在8～17、31～38、43～55、62～67、75～76、82～86、91～102、104～113、126～131、137～142、148～152、158～164、171～176、179～193、196～208、212～223、229～240、244～249、269～273、282～289、305～308、328～331、353～377、376～385、396～400、407～409、417～427、431～437、442～446、456～463、469～477、481～483、490～492、499～528、542～552、562～564、581～582、596～600、607～610、616～628、635～644、649～653和664～678位氨基酸殘基,共352個(gè)氨基酸,共占整個(gè)序列52%。其中,a段125個(gè)氨基酸,占該段序列58.1%,b段91個(gè)氨基酸,占該段序列44.6%;c段150個(gè)氨基酸,占該段序列73.1%。

2.2.5NS3蛋白B細(xì)胞抗原表位。`NS3全蛋白B細(xì)胞抗原表位在393～401、407～412、414～427、431～439、454～459、470～484、490～495、500～530、537～547、549～558、560～566、581～585、594～600、605～608、616～631、636～643、649～655和660～679位氨基酸殘基,共191個(gè)氨基酸,共占整個(gè)氨基酸序列28%,其中,a段153個(gè)氨基酸,占該段序列71.2%,b段125個(gè)氨基酸,占該段序列61.3%,c段134個(gè)氨基酸,占該段序列65.4%。

2.2.6NS3蛋白T細(xì)胞抗原表位。NS3全蛋白T細(xì)胞抗原表位在2～12、13～14、16～20、21～25、27～32、34～56、81～94、99～106、110～113、137～142、158～164、174～185、192～224、234～251、252～271、305～315、332～351、390～397、412～425、434～444、463～487、488～508、513～515、533～557、580～589、602～606、610～617、634～643和664～666位氨基酸殘基,共343個(gè)氨基酸,共占整個(gè)序列的51%。其中,a段105個(gè)氨基酸,占該段48.8%;b段92個(gè)氨基酸,占該段45.0%;c段115個(gè)氨基酸,占該段56.0%(圖2～5)。

圖2 NS3蛋白二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測Fig.2 Prediction of protein secondary structure and epitope of NS3 protein

圖3 NS3蛋白a段二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測Fig.3 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment a

圖4 NS3蛋白b段二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測Fig.4 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment b

圖5 NS3蛋白c段二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測Fig.5 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment c

2.3 NS3a、NS3b和NS3c基因的擴(kuò)增將NS3a、NS3b和NS3c基因PCR擴(kuò)增,分別得到645、609與615 bp的條帶(圖6),與理論大小一致。

注:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1.PCR擴(kuò)增 NS3a基因;2.PCR擴(kuò)增 NS3b基因;3.PCR擴(kuò)增 NS3c基因。Note:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1. PCR amplification of NS3a gene;2. PCR amplification of NS3b gene;3. PCR amplification of NS3c gene.圖6 NS3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of NS3 gene

2.4 重組質(zhì)粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c PCR鑒定pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質(zhì)粒用通用引物T7-P/T進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果與理論大小一致(圖7),且測序結(jié)果正確。

注:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1.pET-28a-NS3a質(zhì)粒;2.pET-28a-NS3b質(zhì)粒;3.pET-28a-NS3c質(zhì)粒;4.pET-28a空載體。Note:M. DL 5 000 DNA ladder marker; 1. PET-28a-NS3a plasmid;2.pET-28a-NS3b plasmid;3.pET-28a-NS3c plasmid;4. pET-28a empty carrier.圖7 重組質(zhì)粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c基因的PCR鑒定結(jié)果Fig.7 PCR identification results of recombinant plasmids pET-28a-NS3a, pET-28a-NS3b, and pET-28a-NS3c genes

2.5 NS3a、NS3b和NS3c蛋白表達(dá)結(jié)果將含pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質(zhì)粒的BL21重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)煮沸變性離心后SDS-PAGE分析,其中,a段表達(dá)量很低且不可溶,b段在27 kD處出現(xiàn)明顯的目的條帶,c段未出現(xiàn)表達(dá)條帶。a段、b段與預(yù)期大小符合,同時(shí)設(shè)置pET-28a空載體組為對照(圖8)。

注:M.蛋白預(yù)染 marker;1.pET-28a空載體;2.pET-28a-NS3a質(zhì)粒;3.pET-28a-NS3b質(zhì)粒;4.pET-28a-NS3c質(zhì)粒;紅框?yàn)槟康臈l帶。Note:M.Protein pre staining marker;1. PET-28a empty carrier;2. PET-28a-NS3a plasmid;3. PET-28a-NS3b plasmid;4. PET-28a-NS3c plasmid;The red box refers to the destination strip.圖8 NS3a、NS3b、NS3c蛋白表達(dá)Fig.8 Protein expression of NS3a、NS3b、NS3c

2.6 重組蛋白CSFV-His-NS3b的純化與活性驗(yàn)證純化與活性驗(yàn)證結(jié)果見圖9。

注:M.蛋白預(yù)染 marker;1. pET-28a空載體對照;2. CSFV-His-NS3b重組蛋白;紅框?yàn)槟康臈l帶。Note:M. Protein pre staining marker;1. PET-28a empty carrier control;2. CSFV His NS3b recombinant protein;the red box refers to the destination strip.圖9 純化CSFV-His-NS3b重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified CSFV-His NS3b recombinant protein

2.7 重組蛋白ELISA濃度測定通過EDXX ELISA試劑盒定量檢測CSFV-His-NS3b重組蛋白,測定蛋白濃度約5 mg/mL,SDS-PAGE分析結(jié)果見圖10。

注:M.蛋白預(yù)染 marker;1.pET-28a空載體對照;2.CSFV-His-NS3b重組蛋白;紅框?yàn)槟康臈l帶。Note:M. Protein pre-staining marker;1.pET-28a empty carrier control;2. CSFV-His-NS3b recombinant protein;the red box refers to the destination strip.圖10 純化CSFV-His-NS3b重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of purified CSFV-His-NS3b recombinant protein

3 討論與分析

近年來,豬瘟病毒已經(jīng)對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大危害,并且該病毒可與其他病原包括PCV2、PRRSV等發(fā)生混合感染[9],使病情加重,因此,及時(shí)有效地診斷可以有效避免繼發(fā)感染帶來的經(jīng)濟(jì)損失,而豬瘟的診斷也一直被作為重點(diǎn)研究對象[10]。NS3蛋白在機(jī)體內(nèi)能誘導(dǎo)NS3特異性抗體產(chǎn)生,且NS3抗體能夠用于區(qū)分自然感染和疫苗毒,因此,NS3蛋白在豬瘟的鑒別診斷中具有重要作用。

NS3蛋白全基因比較長,而小分子的蛋白更容易表達(dá),因此,筆者對NS3蛋白的親水性、抗原表位等功能活性區(qū)域進(jìn)行了分析。二級結(jié)構(gòu)中的α螺旋主要位于205～423位氨基酸,說明該段的穩(wěn)定性比較好;β折疊在37～540位氨基酸均勻分布;β轉(zhuǎn)角在32～175分布比較緊湊,在270～673較分散;無規(guī)則卷曲主要分布在30～436,由于無規(guī)則卷曲β轉(zhuǎn)角在蛋白中的位置,使其成為原表位的可能性較大;親水性分析顯示分布較均勻,沒有明顯波動(dòng);B細(xì)胞表位分析分布于1～277位和415～682位氨基酸,T細(xì)胞表位分析主要位于173～560位氨基酸。選取了a、b、c 3段預(yù)測序列進(jìn)行分段表達(dá)。分割后的結(jié)構(gòu)域和抗原表位百分比相比全長有所增加,3段的抗原表位分布相差不大,均可選為候選抗原蛋白,但是預(yù)測結(jié)果僅可作為參考,最終確定需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)際表達(dá)來驗(yàn)證。

原核表達(dá)這一技術(shù)已經(jīng)非常成熟也易于純化,筆者選擇使用pET-28a原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。其中只有b段區(qū)域能夠表達(dá),a段、c段沒有檢測到表達(dá),且b段可大量表達(dá)且可溶性較好,表達(dá)條件不苛刻,無需摸索,且無需復(fù)可以直接進(jìn)行Ni柱純化。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示條帶單一無雜帶,可見所獲得的蛋白純度非常高。用抗豬CSFV陽性血清進(jìn)行Western-blot試驗(yàn),結(jié)果出現(xiàn)單一的特異性條帶,大小符合實(shí)際大小,用BCA蛋白檢測試劑盒以及ELISA方法均測得蛋白濃度可達(dá)5 mg/mL,說明該重組蛋白不僅表達(dá)量高,其特異性和免疫活性也非常高。

綜上所述,b段相較于a、c段能夠很好地表達(dá),推測可能與其穩(wěn)定性有關(guān),因?yàn)棣谅菪蟹植荚?05～423位氨基酸,并且α螺旋對蛋白的穩(wěn)定性具有重要作用[11]。該研究進(jìn)行的蛋白結(jié)構(gòu)分析及所構(gòu)建的蛋白表對進(jìn)一步研究豬瘟病毒的致病機(jī)理、診斷試劑盒和疫苗的研究與開發(fā)等具有重要意義。