郭錦志,馬士杰,韓先干,付立霞*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)在分類上隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)愛德華菌屬(Edwardsiella),是導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰腸型敗血癥的一種革蘭陰性病原菌[1],近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其亦可感染其他養(yǎng)殖魚類,如黃顙魚、羅非魚、尖吻鱸和斑馬魚等[2-5],呈世界性流行,給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)了巨大危害。鮰愛德華菌的致病性通常認(rèn)為,與其產(chǎn)生的各類毒力因子密切相關(guān),現(xiàn)今已報(bào)道的毒力因子有尿酶、O多糖、溶血素、III型和VI型分泌系統(tǒng)等[6-10]。盡管如此,當(dāng)前對(duì)鮰愛德華菌的感染與致病機(jī)制仍不夠明晰。

密度感應(yīng)系統(tǒng)是普遍存在于細(xì)菌中的一種胞間信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),該系統(tǒng)依賴于細(xì)菌產(chǎn)生的一種稱為自體誘導(dǎo)物(Autoinducer,AI)的信號(hào)分子。在革蘭陰性菌中,介導(dǎo)密度感應(yīng)的信號(hào)分子主要有2類,一類為?；呓z氨酸內(nèi)酯(Acyl homoserine lactones,AHLs)類化合物,另一類為脂類化合物,又稱AI-2,前者主要參與細(xì)菌種內(nèi)的信息交流,后者則主要介導(dǎo)細(xì)菌種間的信息交流[11]。細(xì)菌通過(guò)信號(hào)分子的濃度感知外周細(xì)菌的數(shù)量,進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)以響應(yīng)細(xì)菌群體的密度變化。借助于這一機(jī)制,密度感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、感染和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用[12-13]。

與上述2類信號(hào)分子合成相關(guān)的基因分別為L(zhǎng)uxI和LuxS,其中LuxI編碼AHLs合成酶,而LuxS則為AI-2生物合成中關(guān)鍵因子S-核糖基高半胱氨酸酶的編碼基因[14]。在已發(fā)布的鮰愛德華菌基因組中亦顯示存在LuxI和LuxS同源序列,并對(duì)LuxS的功能進(jìn)行了研究[15-16],但這些研究中的菌株均分離自斑點(diǎn)叉尾鮰,而已有研究顯示不同來(lái)源和地區(qū)的鮰愛德華菌特性存在差異[17]。除此之外,迄今尚鮮見鮰愛德華菌LuxI及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LuxR介導(dǎo)的密度感應(yīng)系統(tǒng)的報(bào)道。鑒于此,筆者通過(guò)對(duì)1株黃顙魚源的鮰愛德華菌的LuxI/LuxR進(jìn)行克隆,并運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,以期為進(jìn)一步研究鮰愛德華菌LuxI/LuxR介導(dǎo)的密度感應(yīng)系統(tǒng)及鮰愛德華菌所致疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料鮰愛德華菌YCH,分離自患紅頭病黃顙魚,由實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。pMD19 T Vector,PrimeSTAR HS(Premix),DNA A-Tailing Kit,DL 2 000 DNA Marker等分子生物學(xué)試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。基因組提取試劑盒DNA Mini Kit及膠回收試劑盒Gel/PCR DNA Fragments Kit等為Geneaid產(chǎn)品。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、LB肉湯和LB瓊脂等培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。鮰愛德華菌日常培養(yǎng)于BHI,大腸桿菌日常培養(yǎng)于LB肉湯,培養(yǎng)溫度分別為28 ℃和37 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)網(wǎng)上已發(fā)布的鮰愛德華菌菌株93-146基因組序列(NC_012779.2),利用Vector NTI 11.5.3 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)?？紤]到不同來(lái)源菌株序列可能存在細(xì)微差異,為保證克隆基因測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,引物設(shè)計(jì)靶序列延展至相應(yīng)基因的上、下游25～46 bp區(qū)域,以避免僅根據(jù)發(fā)布基因5′和3′進(jìn)行引物設(shè)計(jì)可能對(duì)待克隆基因造成的潛在突變。所有引物(表1)均由賽默飛世爾(Thermo Fisher)旗下英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 所用引物及其序列

1.2.2細(xì)菌基因組提取。將30%甘油冷凍保存的鮰愛德華菌接種至BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇,然后以1∶50的比例傳代接種,置于28 ℃氣浴恒溫?fù)u床中以200 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,次日取3 mL菌液分裝于1.5 mL微量離心管中,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min,然后并管收集菌體,利用試劑盒DNA Mini Kit提取鮰愛德華菌基因組,相關(guān)操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行,制備的基因組DNA于20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3LuxI和LuxR基因的PCR擴(kuò)增。以提取的鮰愛德華菌YCH基因組為模板,利用引物L(fēng)uxI-F/LuxI-R和LuxR-F/LuxR-R分別對(duì)基因LuxI和LuxR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL,其中模板和正、反向引物各1 μL,PrimeSTAR HS(Premix)25 μL,最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序:98 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4目的片段的連接和測(cè)序。在紫外分析儀中切下目的片段,通過(guò)膠回收試劑盒Gel/PCR DNA Fragments Kit回收目的片段,然后利用DNA A-Tailing Kit對(duì)回收片段的平滑末端進(jìn)行加“A”操作,再與pMD19 T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,然后均勻涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB抗性平板,放入培養(yǎng)箱中于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出菌落后,用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),利用引物M13-47/M13-48進(jìn)行PCR鑒定,PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆外送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.5生物信息學(xué)分析。將獲得序列通過(guò)NCBI的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性分析,并從中選取部分序列利用MEGA-11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用丹麥技術(shù)大學(xué)生物信息學(xué)平臺(tái)(http://www.cbs.dtu.dk/services/)SignalP、TMHMM和NetPhosBac分別進(jìn)行信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用瑞士生物信息學(xué)研究所ExPASy平臺(tái)(https://www.expasy.org/)Translate推導(dǎo)氨基酸序列,ProtParam確定開放閱讀框(ORF)并預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)(pI)等理化特性,SWISS-MODEL構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)。利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白氨基酸序列的親/疏水性。用PSORTb(https://www.psort.org/psortb/)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位,SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),SMART程序(http://smart.embl.de/)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)功能域。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因LuxI和LuxR的克隆以提取的鮰愛德華菌基因組為模板,引物對(duì)LuxI-F/LuxI-R和LuxR-F/LuxR-R成功擴(kuò)增出大小分別為735 bp和780 bp的含目的基因的預(yù)期片段(圖1)。通過(guò)回收PCR產(chǎn)物并加A后連入pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,利用引物M13-47/M13-48進(jìn)行菌落PCR亦能擴(kuò)增出大小分別為890 bp和936 bp的預(yù)期目的片段(圖2)。

注:M.DNA marker DL 5 000;1.LuxI;2.LuxI空白對(duì)照;3.LuxR;4.LuxR空白對(duì)照。Note:M.DNA marker DL 5 000;1.LuxI;2.LuxI blank control;3.LuxR;4.LuxR blank control.圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of target genes

注:M.DNA marker DL 5 000;1.LuxI;2.LuxR;3.空白對(duì)照。Note:M.DNA marker DL 5 000;1.LuxI;2.LuxR;3.Blank control.圖2 目的克隆的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of target clones

測(cè)序結(jié)果顯示,LuxI基因含有一個(gè)666 bp的開放閱讀框(ORF),編碼221個(gè)氨基酸(圖3A);LuxR基因含有1個(gè)720 bp的開放閱讀框(ORF),編碼239個(gè)氨基酸(圖3B)。將兩者基因序列提交至GenBank,登錄號(hào)分別為MH010542和MH010543。

圖3 LuxI(A)和LuxR(B)基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Fig.3 LuxI(A)and LuxR(B)gene sequence and putative amino acid sequence

2.2 同源性分析BLAST和PSIBLAST同源性檢索分析發(fā)現(xiàn),YCH密度感應(yīng)系統(tǒng)LuxI/LuxR氨基酸序列與其他愛德華菌相應(yīng)系統(tǒng)均有較高的同源性。其中LuxI與E.tarda(WP_012849421.1)的LuxI氨基酸序列的同源性最高,達(dá)95.93%,與E.anguillarum(WP_034164207.1)和E.piscicida(WP_069579107.1)的同源性為95.48%;LuxR與E.tarda(WP_012849420.1)、E.anguillarum(WP_034164208.1)的LuxR氨基酸序列的同源性為96.65%,與E.piscicida(WP_034168511.1)的同源性為96.23%。氨基酸序列同源性比較表明,密度感應(yīng)系統(tǒng)LuxI/LuxR在愛德華菌中是相對(duì)保守的(圖4、5)。

圖4 LuxI基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他愛德華菌同源性分析Fig.4 Multiple sequence alignments of LuxI amino acid sequence with other Edwardsiellas

圖5 LuxR基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他愛德華菌同源性分析Fig.5 Multiple sequence alignments of LuxR amino acid sequence with other Edwardsiella

利用ClustalX軟件對(duì)這2個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì),并根據(jù)比對(duì)結(jié)果利用MEGA-11分子進(jìn)化遺傳分析軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果如圖6所示。YCH密度感應(yīng)系統(tǒng)LuxI/LuxR與鮰愛德華菌、遲緩愛德華菌、殺魚愛德華菌、鰻愛德華菌、?？茞鄣氯A菌聚為一支,這表明相應(yīng)系統(tǒng)的親緣關(guān)系接近,可能來(lái)源于同一個(gè)祖先。

圖6 基于 NJ 法構(gòu)建的 LuxI(A)和 LuxR(B)氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.6 Phylogenetic trees of LuxI(A)and LuxR(B)constructed by neighbour-joining method

2.3 信號(hào)肽、跨膜區(qū)及磷酸化位點(diǎn)分析利用SignalP 4.1 Server對(duì)LuxI和LuxR氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,二者N端區(qū)域均無(wú)明顯剪切位點(diǎn),不存在信號(hào)肽,這也表明兩者均非分泌型蛋白。進(jìn)一步用TMHMM Server 2.0程序分析顯示二者亦不存在跨膜區(qū)。使用NetPhos 3.1 Server軟件對(duì)二者的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,LuxI共有23個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸(Ser,S)14個(gè),蘇氨酸(Thr,T)6個(gè),酪氨酸(Tyr,Y)3個(gè)(圖7A);而LuxR的磷酸化位點(diǎn)為17個(gè),其中絲氨酸(Ser,S)13個(gè),蘇氨酸(Thr,T)2個(gè),酪氨酸(Tyr,Y)2個(gè)(圖7B)。

圖7 LuxI(A)和LuxR(B)蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Fig.7 Protein phosphorylation site analysis of LuxI(A)and LuxR(B)

2.4 亞細(xì)胞定位和基本理化特性PSORTb 3.0.2對(duì)LuxI和LuxR的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,LuxI沒有明確的定位結(jié)果,而LuxR則有很大可能位于胞漿中(9.97)。利用ProtParam軟件對(duì)兩者的理化特性進(jìn)行分析,結(jié)果見表2。

表2 LuxI 和LuxR蛋白的理化性質(zhì)

2.5 親/疏水性分析通過(guò)ProtScale網(wǎng)站分析對(duì)LuxI和LuxR氨基酸序列進(jìn)行親/疏水性分析,其中橫坐標(biāo)表示氨基酸位置,縱坐標(biāo)表示得分,得分大于0表示疏水,反之則表示親水。分析發(fā)現(xiàn),LuxI的最大疏水性氨基酸在其序列的第125號(hào)氨基酸(苯丙氨酸Phe),其值為2.411;最大親水性氨基酸在其197號(hào)氨基酸(脯氨酸Pro),其值為-2.589。LuxR的最大疏水性氨基酸在其序列的第198號(hào)氨基酸(亮氨酸 Leu),其值為1.989;最大親水性氨基酸在其165號(hào)氨基酸(絲氨酸Ser),其值為-2.444。其中LuxR的疏水峰和親水峰更陡峭且位置相近,可能與其具有更加復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。整體來(lái)看,2個(gè)氨基酸的親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中,且數(shù)量多于疏水性氨基酸,多肽鏈表現(xiàn)為親水性(圖8)。

圖8 LuxI(A)和LuxR(B)蛋白疏水性分析Fig.8 Analysis of hydrophobic forecast of LuxI(A)and LuxR(B)

2.6 功能結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用Smart進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析,發(fā)現(xiàn)LuxI蛋白的8～189區(qū)域?qū)儆谧泽w誘導(dǎo)物合成酶(autoinducer synthase)蛋白家族的保守功能區(qū),而LuxR蛋白則有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,即Pfam:Autoind_bind(9-151氨基酸)和HTH_LUXR(171-228氨基酸),其中前者為AHLs的結(jié)合區(qū)域,后者為DNA結(jié)合區(qū)域。

SOPMA 軟件對(duì)LuxI和LuxR的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,二者的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈(β-折疊)組成,其中LuxI的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋37.11%,無(wú)規(guī)卷曲24.43%,β-轉(zhuǎn)角10.41%,延伸鏈28.05%;LuxR的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋42.68%,無(wú)規(guī)卷曲20.92%,β-轉(zhuǎn)角12.55%,延伸鏈23.85%(圖9)。

注:橫軸表示氨基酸位置;藍(lán)色表示α-螺旋,紅色表示 β-折疊延伸鏈,綠表示 β-轉(zhuǎn)角,紫色表示無(wú)規(guī)卷曲。Note:The horizontal axis represented the amino acid position; Blue. α-helix; Red.β-sheet extension chain; Green.β-turn; Purple.random coil.圖9 LuxI(A)和LuxR(B)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Predicting results of secondary structure of LuxI(A)and LuxR(B)

2.7 三維結(jié)構(gòu)的分子模擬根據(jù)同源建模原理,通過(guò)SWISS-Model服務(wù)器在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋選取相似性最高的1K4J.1.A(46.15%,GMQE模型評(píng)估0.72)和5l09.1.A(40.83%,GMQE模型評(píng)估0.78)蛋白作為模板,分別對(duì)LuxI和LuxR進(jìn)行分子模擬,得到推導(dǎo)蛋白的模擬三維分子結(jié)構(gòu)圖,并用VMD軟件對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行編輯美化。結(jié)果顯示,二者在組成上與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合,仍以α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲為主(圖10)。此外,圖10A顯示,LuxI第101位為保守的蘇氨酸活性位點(diǎn),該位點(diǎn)可能與該酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有關(guān)。圖10B顯示,LuxR Pfam:Autoind_bind結(jié)構(gòu)域中位于其第41和69位存在保守的色氨酸活性位點(diǎn),這些位點(diǎn)很可能用于自誘導(dǎo)物方向的固定。

圖10 LuxI(A)和LuxR(B)蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Predicting results of three-dimensional structure of LuxI(A)and LuxR(B)

3 討論與結(jié)論

目前已知的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌密度感應(yīng)系統(tǒng)由LuxI/R-AHLs型QS系統(tǒng)控制,其中LuxI型合成酶以s-腺苷甲硫氨酸和脂酰載體蛋白為底物合成自身誘導(dǎo)物AHLs,當(dāng)細(xì)胞外周環(huán)境中的AHLs積聚到一定濃度時(shí),便可進(jìn)入細(xì)胞與LuxR受體蛋白結(jié)合,形成LuxR-AHLs復(fù)合物與含有LuxI框基因啟動(dòng)子的特定區(qū)域結(jié)合,參與調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成、菌體的運(yùn)動(dòng)、毒素的分泌等諸多方面。因此,阻斷和降解QS信號(hào)分子,抑制受體蛋白的活性,便可以干擾QS系統(tǒng),擾亂生物膜的形成,抑制其毒素產(chǎn)生[18-19]。

LuxI蛋白是一種自誘導(dǎo)劑合成蛋白,其折疊是一種由V形裂縫和深腔混合組成的α-β-α結(jié)構(gòu),V形裂縫頂點(diǎn)的空腔是酶的活性位點(diǎn)[20]。Elshaer等[21]在探究3種非甾體抗炎藥酮洛芬、吡羅昔康和吲哚美辛對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌中的QS活性抑制原理,其中鮑曼不動(dòng)桿菌菌QS由 AbaI/AbaR系統(tǒng)調(diào)節(jié)與革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的LuxI/LuxR標(biāo)準(zhǔn)QS機(jī)制同源。研究發(fā)現(xiàn),這些藥物通過(guò)氫鍵或疏水鍵與AbaI結(jié)合,相對(duì)表達(dá)水平降低了73%～99%。隨后自身誘導(dǎo)劑減少,降低了AbaR基因的表達(dá)。并且這些藥物還顯著抑制了鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的形成和細(xì)胞膜的流動(dòng)性。這表明干擾LuxI的表達(dá)是淬滅QS系統(tǒng)的重要方式之一。

LuxR 蛋白作為自誘導(dǎo)劑感受因子,該蛋白含有2個(gè)主要功能域,即N-末端的AHL結(jié)合域和C-末端的靶基因結(jié)合域。N-末端結(jié)構(gòu)域是一種α-β-α折疊的GAF/PAS結(jié)構(gòu),其中一個(gè)α螺旋與β折疊的凹面形成一個(gè)封閉的口袋,AHL通過(guò)鎖定和穩(wěn)定α-β-α折疊的α-β雙層來(lái)促進(jìn)LuxR蛋白質(zhì)的折疊[20-22]。Rajamanikadan等[23]采用分子對(duì)接發(fā)現(xiàn),肉桂醛衍生物與哈維弧菌LuxR結(jié)合域中極性氨基酸殘基Asn133有明顯的氫鍵作用,并利用形狀和電子藥效團(tuán)虛擬篩選成功篩選出LuxR基因的新型抑制劑3-(2,4-二氯苯基)-1-(1h-吡咯-2-基)-2-丙烯-1- 1,體外測(cè)定其最小抑菌濃度與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)其具有抗QS特性的效力,這提示細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)LuxI/LuxR有可能是潛在的藥物靶標(biāo)。

該研究成功克隆出鮰愛德華菌YCH株LuxI和LuxR的全長(zhǎng)基因。其中LuxI全長(zhǎng)666 bp,編碼221個(gè)氨基酸;LuxR全長(zhǎng)720 bp,編碼239個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn),鮰愛德華菌的密度感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)LuxI/LuxR與其他愛德華菌聚為一支,表明該系統(tǒng)在進(jìn)化中是相對(duì)保守的。利用在線軟件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)LuxI和LuxR均不存在信號(hào)肽,也無(wú)跨膜區(qū),表明其可能位于胞漿中。基本理化性質(zhì)和親/疏水性分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)蛋白均親水LuxI是一種不穩(wěn)定的酸性蛋白,而LuxR則是一種較穩(wěn)定的堿性蛋白。對(duì)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)而言,蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生磷酸化作用會(huì)造成蛋白質(zhì)電位的變化,從而影響蛋白質(zhì)構(gòu)象及蛋白質(zhì)互作等理化過(guò)程[24],其修飾過(guò)程參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng),還與基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及部分癌癥發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[25-26]。當(dāng)前也有研究表明,密度感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子磷酸化與其生物學(xué)功能緊密相關(guān)[27],因此蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析至關(guān)重要。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),2個(gè)蛋白均有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)且多位于功能域內(nèi),這些位點(diǎn)發(fā)生修飾后,可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及調(diào)控其他基因的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。在生物體中蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)其功能往往依托于各種特異的結(jié)構(gòu),同樣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也與其功能密切相關(guān)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,LuxI和LuxR主要由α-螺旋β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲組成,推測(cè)這3種結(jié)構(gòu)是LuxI和LuxR的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)原件。利用SWISS-Model軟件對(duì)LuxI和LuxR蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬,發(fā)現(xiàn)LuxI結(jié)構(gòu)域內(nèi)有明顯的“V”形疏水腔結(jié)構(gòu),LuxR的N-端結(jié)構(gòu)域有α-β-α排列,與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合,將來(lái)可以利用基因敲除或定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)這些結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一些功能位點(diǎn)進(jìn)行重點(diǎn)篩選與驗(yàn)證,為開展密度感應(yīng)抑制藥物篩選提供一定的指導(dǎo)和依據(jù)。