◎ 穆姝夷，黃維皓，周朗君，李綺淇，劉夢(mèng)妮，何敏恒

（1.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511447；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（廣東），廣東 廣州 511447；3.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司廣州分公司，廣東 廣州 510663）

葉黃素是一種類胡蘿卜素，是存在于人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素，能夠幫助視網(wǎng)膜抵御紫外線，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[1]。人體不能合成葉黃素，只能從食物中攝取[2]。葉黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵，容易被氧化失去生物活性[3]。葉黃素酯是葉黃素與長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸形成的酯，是葉黃素在植物中的主要存在形式，在自然界中分布廣泛，經(jīng)人體吸收后分解為游離態(tài)葉黃素[3]。葉黃素酯是多種酯的混合物，包括單酯、雙酯和混合雙酯，其中二棕櫚酸酯是最主要的酯[4]。葉黃素酯的功效與葉黃素相當(dāng)，且對(duì)于溫度、光照的穩(wěn)定性更強(qiáng)，在運(yùn)輸保存過(guò)程中損失較小，適合作為功效成分添加到食品中[5]。

食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在2004 年建議將提取自萬(wàn)壽菊屬的純度為70%的游離葉黃素作為食品添加劑；美國(guó)食品藥品安全監(jiān)督管理局在1995 年已將葉黃素列入食物補(bǔ)充劑名單，于2008 年規(guī)定葉黃素補(bǔ)充劑量為20 mg·d-1[1]；我國(guó)已批準(zhǔn)將以萬(wàn)壽菊油樹脂為原料的葉黃素作為食品添加劑[6]，并發(fā)布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑 葉黃素》（GB 26405—2011）[7]；我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)葉黃素可添加到嬰幼兒配方食品中[8]。2008 年，國(guó)家衛(wèi)生部確立批準(zhǔn)葉黃素酯為功能性新資源食品[9]，含有葉黃素酯成分的飲料、軟糖、壓片糖果等在市場(chǎng)上越來(lái)越受歡迎，行業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)。

常用的檢測(cè)食品中葉黃素含量的方法有紫外-可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-16]。紫外-可見(jiàn)分光光度法是將樣品中的類胡蘿卜素全部提取出來(lái)并測(cè)定吸光度，計(jì)算總類胡蘿卜素含量，再經(jīng)過(guò)液相色譜分離確定總類胡蘿卜素組成，從而得出葉黃素組分的含量，該方法容易受樣品基質(zhì)的干擾，定量穩(wěn)定性差；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葉黃素的含量對(duì)于常量添加定量不準(zhǔn)確，儀器價(jià)格昂貴；高效液相色譜法測(cè)定葉黃素含量穩(wěn)定性高，定量準(zhǔn)確，對(duì)儀器性能要求較低，是目前最常用的檢測(cè)方法。食品中葉黃素的檢測(cè)方法通常參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中葉黃素的測(cè)定》（GB 5009.248—2016）[17]，脂肪含量高的食品需經(jīng)氫氧化鉀溶液室溫皂化，以使葉黃素游離，再用混合溶劑提取，該條件并不能使葉黃素酯轉(zhuǎn)化成葉黃素，可能是飲料中存在的水使皂化效率降低，因此不適用于葉黃素酯的檢測(cè)，且國(guó)標(biāo)中沒(méi)有檢測(cè)葉黃素酯的方法。本文探究了一種飲料中葉黃素酯的檢測(cè)方法，對(duì)樣品中的葉黃素酯先進(jìn)行預(yù)萃取，并比較了不同條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，可為葉黃素酯的測(cè)定研究和市場(chǎng)監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、叔丁基甲醚（色譜純，美國(guó)飛世爾公司）；氯化鈉、無(wú)水乙醇、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醚、氫氧化鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，Anpel）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260 型液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；MS 3 數(shù)顯型渦旋振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；百分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；超純水機(jī)（中國(guó)重慶艾科浦科技有限公司）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；恒溫振蕩水浴器（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；氮吹濃縮儀（瑞典Biotage 集團(tuán)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：YMC 類胡蘿卜素色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為叔丁基甲醚，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：1.00 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：445 nm。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取約2 mg 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解后定容至刻度并混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取適量體積的儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于外標(biāo)法定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液校正

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前需要校正，取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋定容至10 mL，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，測(cè)定3 次，取平均值，根據(jù)式（1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的實(shí)際濃度。

式中：X為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度，mg·L-1；A為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度；2 550 為無(wú)水乙醇中葉黃素的吸光系數(shù)，dL·g-1；10 為稀釋倍數(shù)；10 000 為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，g·dL-1轉(zhuǎn)換為mg·L-1；F為校正系數(shù)，用液相色譜分析標(biāo)準(zhǔn)工作液后計(jì)算得出，反式葉黃素峰面積除以順式與反式葉黃素峰加合總峰面積所得值為校正系數(shù)。

1.3.4 樣品前處理

稱取飲料樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 超純水渦旋混合，加入約5 g 氯化鈉，渦旋30 s 破壁，再加入10 mL 無(wú)水乙醇，渦旋30 s，使體系分散均勻。分3次加入石油醚（15 mL+15 mL）進(jìn)行萃取，渦旋1 min 后靜置分層，收集合并上層溶液至氮吹管中，36 ℃氮吹至近干。向氮吹管中加入異丙醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至25 mL 棕色容量瓶，并加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的氫氧化鉀溶液，用異丙醇定容至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至塑料離心管，60 ℃避光水浴振蕩皂化30 min。冷卻后取1 mL 皂化液于15 mL 塑料離心管，加入2 mL 正己烷渦旋振蕩1 min，再加入約10 mL 超純水，上下輕輕振搖3 次水洗，等待分層后吸取上層溶液，用無(wú)水乙醇稀釋，0.45 μm 濾膜過(guò)濾后經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定。由于葉黃素對(duì)光敏感，所有實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)500 nm 以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 加入淀粉酶的影響

為了探究飲料中添加的葉黃素酯微囊粉原料壁材是否存在淀粉影響預(yù)萃取效率的情況，對(duì)樣品進(jìn)行了淀粉酶酶解30 min 與不加淀粉酶的比較。數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)加入淀粉酶的葉黃素酯測(cè)定結(jié)果比不酶解的低32.7%，說(shuō)明加入淀粉酶不能提高萃取效率，而且還會(huì)造成損失。因此，飲料基質(zhì)不需要淀粉酶酶解。

2.2 加入氯化鈉和無(wú)水乙醇的影響

根據(jù)美國(guó)藥典中葉黃素制劑的方法，添加氯化鈉對(duì)葉黃素酯微囊粉破壁有作用[5]，加入無(wú)水乙醇可以使葉黃素酯在溶液中分散得更加均勻，因此對(duì)是否加入氯化鈉和無(wú)水乙醇進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不加氯化鈉比加入氯化鈉的葉黃素酯測(cè)定結(jié)果低58.8%，不加無(wú)水乙醇比加入無(wú)水乙醇的葉黃素酯測(cè)定結(jié)果低83.1%。因此，選擇萃取前加入氯化鈉和無(wú)水乙醇對(duì)體系進(jìn)行破壁分散。

2.3 萃取溶劑的選擇

根據(jù)葉黃素酯在有機(jī)溶劑中的溶解性，選擇以下試劑對(duì)比萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中，二氯甲烷萃取葉黃素酯測(cè)定結(jié)果最低，石油醚、乙醚、正己烷葉黃素酯測(cè)定結(jié)果接近，但乙醚對(duì)人體和環(huán)境危害較大，且易制毒，受到公安部門管制，正己烷沸點(diǎn)較高，氮吹時(shí)不如石油醚易吹干。綜合考慮，選擇石油醚作為萃取溶劑。

圖1 不同萃取溶劑結(jié)果對(duì)比圖

2.4 萃取體積的選擇

確定石油醚作為萃取溶劑后比較不同體積、萃取次數(shù)的萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，使用30 mL、20 mL石油醚單次萃取結(jié)果偏低，說(shuō)明只進(jìn)行一次萃取的效率較低，應(yīng)該選擇多次萃取。當(dāng)萃取次數(shù)增加到6次時(shí)，結(jié)果與萃取3 次相同，說(shuō)明萃取次數(shù)過(guò)多不能提高回收率。綜合試劑、時(shí)間成本考慮，選擇萃取條件為萃取2 次、每次15 mL。

圖2 不同萃取體積、萃取次數(shù)結(jié)果對(duì)比圖

2.5 皂化溶劑的選擇

選取與流動(dòng)相相溶的異丙醇、無(wú)水乙醇、甲醇作為皂化溶劑，對(duì)比皂化效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。復(fù)溶試劑采取分3 次加入轉(zhuǎn)移的方式，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)復(fù)溶時(shí)無(wú)水乙醇和甲醇的溶解度較差，第1 次加入溶劑時(shí)氮吹管壁上附著的黃色沉淀超聲處理后不能完全溶解，第3 次加入溶劑洗滌時(shí)仍有黃色；異丙醇對(duì)氮吹管內(nèi)固體溶解效果較好，第3 次加入溶劑洗滌時(shí)基本無(wú)色。在皂化溶劑為甲醇時(shí)，渦旋萃取后很快分層，下層黃色更深，加入水振搖靜置后上層有機(jī)相也比其他皂化溶劑體系顏色淺。對(duì)比數(shù)據(jù)，甲醇作為皂化溶劑的測(cè)定結(jié)果比異丙醇低80.7%，無(wú)水乙醇的測(cè)定結(jié)果比異丙醇低10.6%。因此，選擇異丙醇作為皂化溶劑。

圖3 皂化溶劑結(jié)果對(duì)比圖

2.6 皂化堿液加入體積的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇50%氫氧化鉀水溶液作為皂化用堿液，對(duì)比加入不同堿液體積對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)堿液加入體積為0.5 mL 和2.0 mL 時(shí)，測(cè)定結(jié)果相同；體積為1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 時(shí)，測(cè)定結(jié)果接近且偏高一些。但除體積0.5 mL 以外，其他體積均出現(xiàn)堿液與異丙醇分層的情況，溶液分成兩相后計(jì)算含量可能不準(zhǔn)確。因此，應(yīng)盡量減少堿液體積，選擇1 mL為皂化堿液加入體積。

圖4 不同堿液體積結(jié)果對(duì)比圖

實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了皂化液用乙醇稀釋后直接上機(jī)測(cè)定和萃取后再上機(jī)的結(jié)果，選擇了4 個(gè)不同條件的皂化液，皂化液稀釋上機(jī)測(cè)定結(jié)果均比萃取后上機(jī)測(cè)定結(jié)果高102%～109%。但皂化液堿性較強(qiáng)，如果不經(jīng)過(guò)水洗脫堿步驟直接上機(jī)，可能會(huì)對(duì)儀器管路造成損壞，降低儀器使用壽命。因此，不建議將皂化液直接上機(jī)。

2.7 皂化時(shí)間的選擇

皂化條件為60 ℃避光水浴振蕩，對(duì)比不同水浴皂化時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。15 ～120 min的水浴時(shí)間區(qū)間內(nèi)測(cè)定結(jié)果基本相同，說(shuō)明延長(zhǎng)水浴皂化時(shí)間至120 min 不能提高測(cè)定結(jié)果，也沒(méi)有降解造成損失。與皂化30 min 水浴相比，水浴30 min 后室溫放置過(guò)夜再萃取測(cè)定結(jié)果降低，可能是長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致葉黃素降解，但考慮到基質(zhì)組成不同時(shí)，水浴15 min 皂化反應(yīng)可能不完全，因此選擇皂化時(shí)間為水浴30 min。

圖5 不同皂化方式結(jié)果對(duì)比圖

2.8 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

吸取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液于350 ～600 nm 處進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖6，葉黃素于445 nm 處有最大吸收峰。因此，選擇445 nm 作為測(cè)定和校正波長(zhǎng)。

圖6 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液波長(zhǎng)掃描圖

2.9 線性范圍和檢出限

分別吸取適量校正好的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇定容，配制成0.051 5 ～5.150 0 mg·L-1的6 水平系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜儀分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以上機(jī)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=369.69x+3.164，相關(guān)系數(shù)為0.999 98，線性關(guān)系良好。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

根據(jù)空白加標(biāo)的信噪比，計(jì)算得出葉黃素酯的方法檢出限為5.35 mg·kg-1，方法定量限為17.80 mg·kg-1。

2.10 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取6 份均勻飲料試樣，進(jìn)行相同水平的加標(biāo)，按照優(yōu)化后的前處理方法分別對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，加標(biāo)回收率為93.7%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.39%。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

準(zhǔn)確稱取6 份均勻飲料試樣，按照優(yōu)化后的前處理方法分別對(duì)樣品進(jìn)行精密度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，平均值為200 mg·kg-1，精密度為2.24%。

表3 精密度結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了飲料中葉黃素酯含量的檢測(cè)方法，采用YMC 類胡蘿卜素色譜柱，甲醇和叔丁基甲醚為流動(dòng)相，高效液相色譜儀測(cè)定，并對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化，確定一種最佳試驗(yàn)條件：樣品加入氯化鈉和無(wú)水乙醇分散破壁，經(jīng)15 mL 石油醚萃取2 次后吹干溶于異丙醇，加入1 mL 的50%氫氧化鉀溶液，于60 ℃水浴皂化30 min，冷卻后再經(jīng)正己烷萃取，超純水洗滌后無(wú)水乙醇稀釋上機(jī)測(cè)定。該方法具有良好的回收率、重現(xiàn)性和精密度，針對(duì)性強(qiáng)，適用于飲料中葉黃素酯含量的檢測(cè)，可為葉黃素酯的測(cè)定研究和市場(chǎng)監(jiān)管提供參考。