◎ 李冠斯，曹曉鋼，黃學泓，李志勇，魏 霜

（1.汕頭海關技術中心，廣東 汕頭 515031；2.拉薩海關技術中心，西藏 拉薩 850002；3.廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623）

烈性酒作為一種廣泛使用的飲料，在全球范圍內(nèi)擁有廣泛的消費群體[1]。不同類型烈性酒因其獨特的生產(chǎn)工藝、原材料和陳釀方式，具有獨特的香氣和口感，因此受到了廣大消費者的青睞[2]。然而，對于如何根據(jù)特征香氣物質(zhì)準確識別和分類不同類型烈性酒，以及如何對其進行科學評價，仍需進一步研究和探討。近年來，隨著分析技術的發(fā)展，越來越多的研究開始關注不同類型烈性酒的非靶標代謝物質(zhì)[3]。這些非靶標代謝物決定了烈性酒的香氣和口感，對于評價烈性酒的質(zhì)量和等級具有重要意義[4]。氣質(zhì)聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術作為一種有效的分析方法[5]，能夠分離和鑒定烈性酒中的非靶標代謝組學物質(zhì)，為研究不同類型烈性酒的特征香氣物質(zhì)提供了有力支持[6]。然而，單純依靠GC-MS 技術對烈性酒進行分析，難以全面揭示其特征香氣物質(zhì)的種類和含量，也無法進行很好的歸類識別。因此，本研究利用GC-MS 技術結(jié)合聚類分析（Cluster Analysis，CA）、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）等組學分析手段[7-8]，對6 種不同類型烈性酒的非靶標代謝組學物質(zhì)進行分析，旨在為我國進出口監(jiān)管部門在不同類型及品牌烈性酒的識別與歸類監(jiān)管上提供更加科學、可靠的支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

6 個類型的酒樣：WSC 系列威士忌酒樣（編號為WSC1 ～WSC50）50 瓶、W14 系列威士忌酒樣（編號為W141 ～W1450）50 瓶、W18 系列威士忌酒樣（編號為W181 ～W1850）50 瓶、MXO 系列白蘭地酒樣（編號為MXO1～MXO50）50瓶、LXO系列白蘭地酒樣（編號為LXO1 ～LXO50）50 瓶、HXO 系列白蘭地酒樣（編號為HXO1 ～HXO50）50 瓶。6 個類型對應的假酒樣品（假酒樣品來源為廠商收繳所得的市場假冒商品）。樣本編號見表1。

表1 不同烈性酒酒樣一覽表

Agilent 5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent Technologies公司；實驗用水，實驗室自制超純水，Millipore Simplicity 超純水系統(tǒng)，上海彤迪科學儀器有限公司。

1.2 儀器條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAX-UI 型彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1.0 min，以5 ℃·min-1的升溫速率升至250 ℃，保持10.0 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（純度≥99.99%）；流速1.0 mL·min-1；分流比10 ∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源；電離能70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；全掃描監(jiān)測模式，質(zhì)量掃描范圍35 ～500 amu；溶劑延遲1 min。

1.3 烈性酒的定量與定性

在常規(guī)檢測任務中，對烈性酒中的非靶標代謝物的定性主要采用標準品直接比對法，然而，在某些特殊情況下，為滿足檢測快速便捷要求，也可采用質(zhì)譜庫檢索對比方式進行[9]。本研究采用質(zhì)譜庫檢索對比方式，使用的軟件為NIST MS Search v.2.0 和Agilent MassHunter 中 的Qualitative Navigator B.08.00， 將GC-MS 識別的非靶標代謝物與美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）質(zhì)譜庫進行對比，再手動篩選出正、反匹配度大于700、可能性大于90%的非靶標代謝物，同時需滿足保留時間在±0.5 s。烈性酒中揮發(fā)性成分的定量分析采用相對豐度表示化合物的含量，即使用其質(zhì)譜峰的峰面積表示含量，因為化合物含量與其相應質(zhì)譜峰峰面積成正比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 得到的數(shù)據(jù)先進行歸一化處理，再做化學計量學分析，并整理統(tǒng)計和繪圖。以上所有分析均使用R 4.2.3 完成。其中使用PCA 包做主成分分析及繪圖，使用hclust 包繪制層次聚類，使用ropls 包做偏最小二乘法判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烈性酒非靶標代謝組學物質(zhì)GC-MS 分析

烈性酒酒樣揮發(fā)性成分的檢測均采用GC-MS 方法，GC-MS 分析總離子流色譜圖見圖1（a ～f 分別代表6種烈性酒，圖中僅展示部分非靶標代謝物名稱）。由圖1 可知，6 種烈性酒共檢測出61 種非靶標代謝物，包括醇類21 種，酯類10 種，酸類14 種，醛酮類6 種。

圖1 不同烈性酒酒樣中揮發(fā)性成分GC-MS 分析總離子流色譜圖

通過NIST 質(zhì)譜圖庫檢索分析，按照不同類型的酒樣，得到非靶標代謝組學物質(zhì)對比圖，見圖2。從圖中可以看出，非靶標代謝組學物質(zhì)中最多的為酯類化合物和醇類化合物。

圖2 不同類型烈性酒非靶標代謝組學物質(zhì)對比圖

采用GC-MS 對不同類型及品牌烈性酒中的非靶標代謝物進行分析，結(jié)果表明不同類型及品牌烈性酒中的非靶標代謝物含量和種類差異較大，利用非靶標代謝物這一基礎對不同類型及品牌烈性酒進行組學分析是可行的。

2.2 不同烈性酒的揮發(fā)性成分聚類分析

聚類分析法是組學分析方法中的重要方法，聚類分析對不同類型及品牌烈性酒中揮發(fā)性及非揮發(fā)性非靶標代謝物歸類與識別研究以及產(chǎn)品等級和劃分都具有重要的參考價值[10]。

選取6 種不同類型及品牌烈性酒經(jīng)過GC-MS 分析，利用檢測出的61 種非靶標代謝物進行分析聚類分析（由于樣本數(shù)較大，此處僅隨機選擇每種酒的10 個樣本），分層聚類方法采用歐氏距離度量，并使用平均值聚類算法。由圖3（a）和（b）可知，6 種不同類型及品牌烈性酒分布較為集中，每種烈性酒均可自己歸納為一類。W14、WSC、W18 這3 款酒分布較為集中，說明其非靶標代謝物組成較為相似，初步判定這3 款酒為同類型烈性酒。HXO、MXO 兩款酒分布較為集中，與LXO 差異較大，說明其在非靶標代謝物組成上有較大差異，這可能與這3 款酒制作工藝、使用原料、儲存時間不同有關。

圖3 不同類型的烈性酒酒樣中揮發(fā)性非靶標代謝組學物質(zhì)的聚類分析圖

2.3 不同種類烈性酒揮發(fā)性成分主成分分析

對6 種不同類型及品牌烈性酒數(shù)據(jù)進行主成分分析，取6 種烈性酒酒中前3 個主成分得分做三維和二維的得分散點圖。如圖4 所示，主成分分析在6 種烈性酒的區(qū)分上具有同聚類分析一樣的效果，6 種不同類型及品牌烈性酒在二維和三維的得分散點圖中均能有效分開，并無發(fā)生重疊現(xiàn)象。從二維散點圖可以看出，WSC、W14、W18、MXO 和LXO 這5 種烈性酒相距較近，且W14、WSC、W18 這3 款酒分布均集中在同一象限，而MXO、LXO 和HXO 各單獨占據(jù)一個象限。同時，還可見HXO 與其他酒距離較遠的同時聚集效果較為松散，沒有其他5 種類型及品牌烈性酒聚集。

圖4 不同類型烈性酒酒樣前3 個主成分的三維散點圖及二維散點圖

2.4 不同類型烈性酒的偏最小二乘法判別分析

在主成分分析的基礎上，本研究對6 種不同類型及品牌烈性酒進行PLS-DA 分析，并得到烈性酒非靶標代謝物對應的變量投影重要性（Variable Importance in Projection，VIP）得分。利用6 種不同類型及品牌烈性酒在這2 個成分中的得分做散點圖。如圖5 所示，WSC、W14 和W18 這3 款酒較為聚集，MXO 和LXO兩款酒較為聚集，HXO 聚類效果較為松散，且與其他5 款酒距離較遠。

圖5 不同類型烈性酒酒樣偏最小二乘法判別分析散點圖

VIP 量化了每個非靶標代謝物在組學分析中的重要性，VIP 值越高表示在烈性酒組學分析中的差異權重越大，對非靶標代謝物組學歸類技術的貢獻值越大。本研究選擇VIP 值排名前15 的非靶標代謝物進行展示，詳見見表2。在6 種不同類型及品牌烈性酒中，VIP值最高的物質(zhì)為十二烷二酸二甲酯，VIP 值排名前15的非靶標代謝物中，有4 種酯類化合物、3 種醇類化合物、2 種糖類化合物、1 種酸類化合物、5 種其他物質(zhì)。這些非靶標代謝物對6 種不同類型及品牌烈性酒的歸類識別權重較大，可作為烈性酒生產(chǎn)過程中的特征化合物控制指標，也可以應用于進出口烈性酒監(jiān)管中的酒類歸類識別和真實性判別，具有較大研究價值。

表2 VIP 值排名前15 的特征物質(zhì)一覽表

3 烈性酒的歸類識別驗證

為了進一步驗證上述烈性酒非靶標代謝物組學分析技術，本研究從廠商處獲取從市場收繳的假冒酒，同樣采用聚類分析和PLS-DA分析兩種方法進行判定。聚類分析主要觀察測試樣本與訓練集中哪一類樣本分布在同一棵聚類樹下，如果測試樣本單獨在一棵聚類樹下，則判斷為假酒。PLS-DA 分析主要觀察散點圖中測試樣本與訓練集中哪一類樣本相距較近，從而判斷其種類，如果測試樣本單獨形成一個類，則判斷為假酒。

從圖6 可以看出，層次聚類中，假酒被單獨分到了一個聚類樹，而PLS-DA 分析中測試樣本距離訓練集樣本在PC1 及PC2 中的距離均大于1。因此可以得出，通過聚類分析和PLS-DA 分析兩種方法均可判定假酒不屬于訓練集樣本中的任一類型，上述烈性酒非靶標代謝物組學分析技術驗證為可行。

圖6 摻偽烈性酒酒樣的判別分析圖

4 結(jié)論

本研究以非靶向代謝組學技術為基礎，通過氣質(zhì)聯(lián)用技術對6 種不同類型烈性酒的非靶標代謝組學物質(zhì)進行分析，并結(jié)合主成分分析、聚類分析及偏最小二乘法判別分析等化學計量學手段對檢測結(jié)果進行分析，建立了一套基于非靶標代謝組學的不同烈性酒識別與歸類技術。在6 種不同烈性酒共檢測出61 種揮發(fā)性成分，包括醇類21 種，酯類10 種，酸類14 種，醛酮類6 種，其中，4 種脂類、3 種醇類、1 種酸類、2 種糖類及5 種其他物質(zhì)造成酒樣差異中的權重較大。通過聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法判別分析能夠很好地歸類識別6 種烈性酒。本研究建立了一種適合推廣的烈性酒快速歸類與識別技術，為酒類產(chǎn)品的真實性鑒定提供參考，有利于加強知識產(chǎn)權保護，該技術能有效打擊進出口侵權違法行為，維護公平有序的進出口貿(mào)易秩序，為國內(nèi)外創(chuàng)新主體提供良好的營商環(huán)境和有力的法治保障。