◎ 李冠斯，曹曉鋼，黃學(xué)泓，李志勇，魏 霜

（1.汕頭海關(guān)技術(shù)中心，廣東 汕頭 515031；2.拉薩海關(guān)技術(shù)中心，西藏 拉薩 850002；3.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

烈性酒作為一種廣泛使用的飲料，在全球范圍內(nèi)擁有廣泛的消費(fèi)群體[1]。不同類型烈性酒因其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝、原材料和陳釀方式，具有獨(dú)特的香氣和口感，因此受到了廣大消費(fèi)者的青睞[2]。然而，對于如何根據(jù)特征香氣物質(zhì)準(zhǔn)確識別和分類不同類型烈性酒，以及如何對其進(jìn)行科學(xué)評價(jià)，仍需進(jìn)一步研究和探討。近年來，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究開始關(guān)注不同類型烈性酒的非靶標(biāo)代謝物質(zhì)[3]。這些非靶標(biāo)代謝物決定了烈性酒的香氣和口感，對于評價(jià)烈性酒的質(zhì)量和等級具有重要意義[4]。氣質(zhì)聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術(shù)作為一種有效的分析方法[5]，能夠分離和鑒定烈性酒中的非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)，為研究不同類型烈性酒的特征香氣物質(zhì)提供了有力支持[6]。然而，單純依靠GC-MS 技術(shù)對烈性酒進(jìn)行分析，難以全面揭示其特征香氣物質(zhì)的種類和含量，也無法進(jìn)行很好的歸類識別。因此，本研究利用GC-MS 技術(shù)結(jié)合聚類分析（Cluster Analysis，CA）、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）等組學(xué)分析手段[7-8]，對6 種不同類型烈性酒的非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為我國進(jìn)出口監(jiān)管部門在不同類型及品牌烈性酒的識別與歸類監(jiān)管上提供更加科學(xué)、可靠的支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

6 個(gè)類型的酒樣：WSC 系列威士忌酒樣（編號為WSC1 ～WSC50）50 瓶、W14 系列威士忌酒樣（編號為W141 ～W1450）50 瓶、W18 系列威士忌酒樣（編號為W181 ～W1850）50 瓶、MXO 系列白蘭地酒樣（編號為MXO1～MXO50）50瓶、LXO系列白蘭地酒樣（編號為LXO1 ～LXO50）50 瓶、HXO 系列白蘭地酒樣（編號為HXO1 ～HXO50）50 瓶。6 個(gè)類型對應(yīng)的假酒樣品（假酒樣品來源為廠商收繳所得的市場假冒商品）。樣本編號見表1。

表1 不同烈性酒酒樣一覽表

Agilent 5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent Technologies公司；實(shí)驗(yàn)用水，實(shí)驗(yàn)室自制超純水，Millipore Simplicity 超純水系統(tǒng)，上海彤迪科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAX-UI 型彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1.0 min，以5 ℃·min-1的升溫速率升至250 ℃，保持10.0 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（純度≥99.99%）；流速1.0 mL·min-1；分流比10 ∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源；電離能70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；全掃描監(jiān)測模式，質(zhì)量掃描范圍35 ～500 amu；溶劑延遲1 min。

1.3 烈性酒的定量與定性

在常規(guī)檢測任務(wù)中，對烈性酒中的非靶標(biāo)代謝物的定性主要采用標(biāo)準(zhǔn)品直接比對法，然而，在某些特殊情況下，為滿足檢測快速便捷要求，也可采用質(zhì)譜庫檢索對比方式進(jìn)行[9]。本研究采用質(zhì)譜庫檢索對比方式，使用的軟件為NIST MS Search v.2.0 和Agilent MassHunter 中 的Qualitative Navigator B.08.00， 將GC-MS 識別的非靶標(biāo)代謝物與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）質(zhì)譜庫進(jìn)行對比，再手動篩選出正、反匹配度大于700、可能性大于90%的非靶標(biāo)代謝物，同時(shí)需滿足保留時(shí)間在±0.5 s。烈性酒中揮發(fā)性成分的定量分析采用相對豐度表示化合物的含量，即使用其質(zhì)譜峰的峰面積表示含量，因?yàn)榛衔锖颗c其相應(yīng)質(zhì)譜峰峰面積成正比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 得到的數(shù)據(jù)先進(jìn)行歸一化處理，再做化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，并整理統(tǒng)計(jì)和繪圖。以上所有分析均使用R 4.2.3 完成。其中使用PCA 包做主成分分析及繪圖，使用hclust 包繪制層次聚類，使用ropls 包做偏最小二乘法判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烈性酒非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)GC-MS 分析

烈性酒酒樣揮發(fā)性成分的檢測均采用GC-MS 方法，GC-MS 分析總離子流色譜圖見圖1（a ～f 分別代表6種烈性酒，圖中僅展示部分非靶標(biāo)代謝物名稱）。由圖1 可知，6 種烈性酒共檢測出61 種非靶標(biāo)代謝物，包括醇類21 種，酯類10 種，酸類14 種，醛酮類6 種。

圖1 不同烈性酒酒樣中揮發(fā)性成分GC-MS 分析總離子流色譜圖

通過NIST 質(zhì)譜圖庫檢索分析，按照不同類型的酒樣，得到非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)對比圖，見圖2。從圖中可以看出，非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)中最多的為酯類化合物和醇類化合物。

圖2 不同類型烈性酒非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)對比圖

采用GC-MS 對不同類型及品牌烈性酒中的非靶標(biāo)代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同類型及品牌烈性酒中的非靶標(biāo)代謝物含量和種類差異較大，利用非靶標(biāo)代謝物這一基礎(chǔ)對不同類型及品牌烈性酒進(jìn)行組學(xué)分析是可行的。

2.2 不同烈性酒的揮發(fā)性成分聚類分析

聚類分析法是組學(xué)分析方法中的重要方法，聚類分析對不同類型及品牌烈性酒中揮發(fā)性及非揮發(fā)性非靶標(biāo)代謝物歸類與識別研究以及產(chǎn)品等級和劃分都具有重要的參考價(jià)值[10]。

選取6 種不同類型及品牌烈性酒經(jīng)過GC-MS 分析，利用檢測出的61 種非靶標(biāo)代謝物進(jìn)行分析聚類分析（由于樣本數(shù)較大，此處僅隨機(jī)選擇每種酒的10 個(gè)樣本），分層聚類方法采用歐氏距離度量，并使用平均值聚類算法。由圖3（a）和（b）可知，6 種不同類型及品牌烈性酒分布較為集中，每種烈性酒均可自己歸納為一類。W14、WSC、W18 這3 款酒分布較為集中，說明其非靶標(biāo)代謝物組成較為相似，初步判定這3 款酒為同類型烈性酒。HXO、MXO 兩款酒分布較為集中，與LXO 差異較大，說明其在非靶標(biāo)代謝物組成上有較大差異，這可能與這3 款酒制作工藝、使用原料、儲存時(shí)間不同有關(guān)。

圖3 不同類型的烈性酒酒樣中揮發(fā)性非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)的聚類分析圖

2.3 不同種類烈性酒揮發(fā)性成分主成分分析

對6 種不同類型及品牌烈性酒數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，取6 種烈性酒酒中前3 個(gè)主成分得分做三維和二維的得分散點(diǎn)圖。如圖4 所示，主成分分析在6 種烈性酒的區(qū)分上具有同聚類分析一樣的效果，6 種不同類型及品牌烈性酒在二維和三維的得分散點(diǎn)圖中均能有效分開，并無發(fā)生重疊現(xiàn)象。從二維散點(diǎn)圖可以看出，WSC、W14、W18、MXO 和LXO 這5 種烈性酒相距較近，且W14、WSC、W18 這3 款酒分布均集中在同一象限，而MXO、LXO 和HXO 各單獨(dú)占據(jù)一個(gè)象限。同時(shí)，還可見HXO 與其他酒距離較遠(yuǎn)的同時(shí)聚集效果較為松散，沒有其他5 種類型及品牌烈性酒聚集。

圖4 不同類型烈性酒酒樣前3 個(gè)主成分的三維散點(diǎn)圖及二維散點(diǎn)圖

2.4 不同類型烈性酒的偏最小二乘法判別分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上，本研究對6 種不同類型及品牌烈性酒進(jìn)行PLS-DA 分析，并得到烈性酒非靶標(biāo)代謝物對應(yīng)的變量投影重要性（Variable Importance in Projection，VIP）得分。利用6 種不同類型及品牌烈性酒在這2 個(gè)成分中的得分做散點(diǎn)圖。如圖5 所示，WSC、W14 和W18 這3 款酒較為聚集，MXO 和LXO兩款酒較為聚集，HXO 聚類效果較為松散，且與其他5 款酒距離較遠(yuǎn)。

圖5 不同類型烈性酒酒樣偏最小二乘法判別分析散點(diǎn)圖

VIP 量化了每個(gè)非靶標(biāo)代謝物在組學(xué)分析中的重要性，VIP 值越高表示在烈性酒組學(xué)分析中的差異權(quán)重越大，對非靶標(biāo)代謝物組學(xué)歸類技術(shù)的貢獻(xiàn)值越大。本研究選擇VIP 值排名前15 的非靶標(biāo)代謝物進(jìn)行展示，詳見見表2。在6 種不同類型及品牌烈性酒中，VIP值最高的物質(zhì)為十二烷二酸二甲酯，VIP 值排名前15的非靶標(biāo)代謝物中，有4 種酯類化合物、3 種醇類化合物、2 種糖類化合物、1 種酸類化合物、5 種其他物質(zhì)。這些非靶標(biāo)代謝物對6 種不同類型及品牌烈性酒的歸類識別權(quán)重較大，可作為烈性酒生產(chǎn)過程中的特征化合物控制指標(biāo)，也可以應(yīng)用于進(jìn)出口烈性酒監(jiān)管中的酒類歸類識別和真實(shí)性判別，具有較大研究價(jià)值。

表2 VIP 值排名前15 的特征物質(zhì)一覽表

3 烈性酒的歸類識別驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述烈性酒非靶標(biāo)代謝物組學(xué)分析技術(shù)，本研究從廠商處獲取從市場收繳的假冒酒，同樣采用聚類分析和PLS-DA分析兩種方法進(jìn)行判定。聚類分析主要觀察測試樣本與訓(xùn)練集中哪一類樣本分布在同一棵聚類樹下，如果測試樣本單獨(dú)在一棵聚類樹下，則判斷為假酒。PLS-DA 分析主要觀察散點(diǎn)圖中測試樣本與訓(xùn)練集中哪一類樣本相距較近，從而判斷其種類，如果測試樣本單獨(dú)形成一個(gè)類，則判斷為假酒。

從圖6 可以看出，層次聚類中，假酒被單獨(dú)分到了一個(gè)聚類樹，而PLS-DA 分析中測試樣本距離訓(xùn)練集樣本在PC1 及PC2 中的距離均大于1。因此可以得出，通過聚類分析和PLS-DA 分析兩種方法均可判定假酒不屬于訓(xùn)練集樣本中的任一類型，上述烈性酒非靶標(biāo)代謝物組學(xué)分析技術(shù)驗(yàn)證為可行。

圖6 摻偽烈性酒酒樣的判別分析圖

4 結(jié)論

本研究以非靶向代謝組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對6 種不同類型烈性酒的非靶標(biāo)代謝組學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，并結(jié)合主成分分析、聚類分析及偏最小二乘法判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，建立了一套基于非靶標(biāo)代謝組學(xué)的不同烈性酒識別與歸類技術(shù)。在6 種不同烈性酒共檢測出61 種揮發(fā)性成分，包括醇類21 種，酯類10 種，酸類14 種，醛酮類6 種，其中，4 種脂類、3 種醇類、1 種酸類、2 種糖類及5 種其他物質(zhì)造成酒樣差異中的權(quán)重較大。通過聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法判別分析能夠很好地歸類識別6 種烈性酒。本研究建立了一種適合推廣的烈性酒快速歸類與識別技術(shù)，為酒類產(chǎn)品的真實(shí)性鑒定提供參考，有利于加強(qiáng)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，該技術(shù)能有效打擊進(jìn)出口侵權(quán)違法行為，維護(hù)公平有序的進(jìn)出口貿(mào)易秩序，為國內(nèi)外創(chuàng)新主體提供良好的營商環(huán)境和有力的法治保障。