◎ 閆景勇，劉建華，阮沖沖，李潔珠

（廣東廚邦食品有限公司，廣東 陽江 529500）

醬油原油的釀造過程可分為三大環(huán)節(jié)，即原料制曲、醬醪發(fā)酵及原油分離。原料制曲是醬油釀造工藝的關鍵環(huán)節(jié)，是米曲霉生長分泌各種酶的過程，是醬醪發(fā)酵過程原料分解、物質轉化的基礎。一般來說，米曲霉在制曲過程中經(jīng)歷孢子吸水發(fā)芽期、菌絲生長繁殖期和孢子著生期3 個階段[1]。原料制曲首先要進行種曲培養(yǎng)，即通過上述3 個階段培養(yǎng)68 ～72 h 以實現(xiàn)米曲霉菌種的擴大培養(yǎng)而獲得成熟種曲；接下來是進行大曲培養(yǎng)，即將成熟種曲與小麥粉、蒸煮冷卻后的黃豆混合培養(yǎng)40 ～44 h，低溫制曲工藝中大曲培養(yǎng)初期6 ～8 h 是米曲霉孢子吸水發(fā)芽期，此階段米曲霉尚未形成生長優(yōu)勢來抑制雜菌的侵入，溫度過低或過高均會造成雜菌的污染繁殖[2]，進而易產(chǎn)生花曲、酸曲等品質問題。

圓盤通風制曲機是一種自動化、精準化的醬油制曲設備，目前國內多數(shù)的大型醬油廠都在使用該設備[3]。在實際生產(chǎn)過程中，空氣由單一入口進入下風室，在下風室形成明顯的高速和低速區(qū)，造成氣流組織不均勻[4]。由于高速區(qū)占比相對較?。s占1/8 盤面），故而圓盤制曲是以低速區(qū)的曲料溫度進行溫度控制，如此就會出現(xiàn)低速區(qū)曲料溫度合適時高速區(qū)曲料溫度偏低的問題，進而易出現(xiàn)高速區(qū)曲料培養(yǎng)前期米曲霉孢子發(fā)芽緩慢而易染雜菌造成圓盤局部大曲（6%～12%）酸曲/花曲的品質問題，從而影響產(chǎn)品質量。

本研究通過采用醬油種曲四段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段后增加種曲預處理期使成熟種曲的孢子在種曲機內達到發(fā)芽的狀態(tài)而獲得制曲菌種；再將其接種至原料進行大曲培養(yǎng)，使大曲培養(yǎng)跳過孢子吸水發(fā)芽期、直接進入生長繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競爭優(yōu)勢，抑制雜菌的污染繁殖，驗證其對解決圓盤大曲局部酸曲/花曲品質問題的有效性。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

菌種：米曲霉3.042，由廣東美味鮮調味食品有限公司提供。

原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購，符合國家標準即可；頭油，為廣東廚邦食品有限公司廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝所產(chǎn)的第一道醬油原油。

1.2 儀器與設備

IKA RH 磁力攪拌器，廣州綠百草科學儀器有限公司；25×16 血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100 顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；LRH 生化培養(yǎng)箱與DHG-9140A 電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；T6 新銳可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；種曲機，江蘇華暉環(huán)保科技有限公司；連續(xù)蒸煮機與大型圓盤制曲機，北京鍵聯(lián)機械設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

麩皮與水混合均勻后裝入曲盤，厚度控制在1.0 ～1.5 cm，于種曲機內進行高溫滅菌、冷卻后，接入三角瓶菌種，開展醬油種曲四階段培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度控制在30 ～34 ℃，先通過孢子吸水發(fā)芽期、菌絲生長繁殖期、孢子著生期三大階段培養(yǎng)至72 h 以實現(xiàn)菌種的擴大培養(yǎng)而獲得成熟種曲，再通過優(yōu)化研究適宜條件繼續(xù)開展第4 階段（種曲預處理期）培養(yǎng)使成熟種曲的孢子達到發(fā)芽狀態(tài)而獲得制曲菌種。

黃豆經(jīng)蒸煮冷卻后，與面粉、制曲菌種充分混勻后進入圓盤制曲機內，厚度一般為40 ～50 cm，控制溫度為32 ～38 ℃，培養(yǎng)6 ～8 h 后進行第一次松曲，控制溫度為30 ～34 ℃，培養(yǎng)15 ～17 h 后進行第二次松曲，控制溫度為26 ～30 ℃，培養(yǎng)32 ～34 h 后獲得成熟大曲。如此不僅可有效解決圓盤局部大曲酸曲/花曲的品質問題，同時可在確保大曲質量的前提下縮短制曲時間，從而提升產(chǎn)品質量且大大降低圓盤制曲的能耗成本。具體的工藝流程見圖1。

圖1 醬油種曲四階段培養(yǎng)法的制曲工藝流程圖

1.3.2 不同加濕量對制曲菌種的影響

第4 階段使用自來水分別按照100 mL·min-1、150 mL·min-1、200 mL·min-1、250 mL·min-1的加濕量進行加濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標，確定合適的加濕量。

1.3.3 不同加濕水對制曲菌種的影響

第4 階段分別使用含0%、5%、10%、15%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量進行加濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標，確定適宜的加濕水。

1.3.4 不同通風方案對制曲菌種的影響

第4 階段使用含10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量進行加濕培養(yǎng)，并設計不同通風方案（見表1）進行通風培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標，確定適宜的通風方案。

表1 醬油種曲四段培養(yǎng)法中種曲預處理期通風方案試驗組別設計表

1.3.5 不同預處理時長對制曲菌種的影響

第4 階段使用含10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量，并采用1.3.4 中試驗方案2 的通風方案進行加濕通風培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至8 h、10 h、12 h、14 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標，確定合適的四階段培養(yǎng)時長。

1.3.6 制曲菌種減時制曲試驗

以成熟大曲的中性蛋白酶活力、感官（重點是有無酸曲/花曲）為判定指標，以酸性蛋白酶活力為參考指標，將黃豆經(jīng)蒸煮冷卻后，與面粉、制曲菌種充分混勻后，分別于圓盤制曲機培養(yǎng)28 h、30 h、32 h、34 h、36 h 和38 h 取樣檢測大曲理化與微檢指標，并觀察記錄其大曲感官狀態(tài)。

1.3.7 各項指標測定方法

（1）制曲菌種孢子發(fā)芽率的測定。參照《孢子數(shù)測定法》（SB/T 10315—1999）[5]對制曲菌種進行樣品處理、制片、鏡檢，鏡檢時選取計數(shù)板四周與中間各一個區(qū)域，分別記錄已發(fā)芽孢子數(shù)目和未發(fā)芽孢子數(shù)目。制曲菌種孢子發(fā)芽率會影響到大曲培養(yǎng)相關試驗結果的準確性，為確保試驗質量，以制曲菌種孢子發(fā)芽率≥85%為目標[6]。制曲菌種孢子發(fā)芽率計算為

（2）大曲質量指標的測定。中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力參照《蛋白酶活力測定》（SB/T 10317—1999）[7]。

2 結果與分析

2.1 不同加濕量對制曲菌種的影響

水是米曲霉孢子發(fā)芽必不可少的，不同加濕量對制曲菌種孢子發(fā)芽的影響見圖2。由圖2 可知，隨著加濕量的增加，制曲菌種孢子發(fā)芽率呈上升趨勢，當加濕量達到200 mL·min-1后其孢子發(fā)芽率上升不明顯，這可能是米曲霉孢子吸水的速率在200 mL·min-1的加濕量下已達到最大水平，加濕量繼續(xù)增加但水分并不能被孢子有效吸收。因而，綜合考慮發(fā)芽率與加濕成本，選定四階段培養(yǎng)的加濕量為200 mL·min-1。

圖2 加濕量對制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

2.2 不同加濕水對制曲菌種的影響

醬油種曲經(jīng)歷前三階段的培養(yǎng)形成大量孢子，此時原本培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質基本消耗殆盡。在醬油種曲四階段培養(yǎng)時，適當補充營養(yǎng)物質有利于米曲霉孢子的再次發(fā)芽。本試驗通過在加濕水中混入一定比例的含有大量氨基酸、還原糖等可被直接利用的營養(yǎng)物質頭油進行加濕培養(yǎng)，以促進孢子的發(fā)芽，其試驗結果如圖3 所示。

圖3 加濕水中頭油含量對制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

由圖3 可知，當加濕水中添加5 ～15%頭油時，其對應的制曲菌種孢子發(fā)芽率均高于不添加的組別，說明適當補充營養(yǎng)物質確實可促進成熟種曲孢子的再次發(fā)芽。其中，添加量在10%與15%時促進效果基本一致，可使制曲菌種孢子發(fā)芽率達到約70%，明顯高于添加量為5%的組別，比不添加的組別對應的孢子發(fā)芽率約高6.4%。因此，該試驗選用含有10%頭油的自來水作為加濕水。

2.3 不同通風方案對制曲菌種的影響

由圖4 可知，通風方案從對照方案不通風到試驗方案1 ～4 逐步增加通風時長，其對應的制曲菌種孢子發(fā)芽率整體呈上升趨勢。從總體來看，采用試驗方案2 ～4 時，制曲菌種孢子發(fā)芽率處于較高水平且發(fā)芽率水平基本一致，是促進孢子再次發(fā)芽較適宜的通風方案。隨著時間的推移，孢子陸續(xù)開始發(fā)芽，對氧的需求會逐步增加且會逐步產(chǎn)生呼吸熱，適時的通風有利于供氧散熱、避免局部高溫，使整體溫度更加均一而有利于孢子的萌發(fā)；但前期孢子僅是吸水膨脹，故而對氧基本無需求，因此試驗方案3、4 雖通風時間更長但其對應的制曲菌種孢子發(fā)芽率并未顯著高于試驗方案2。綜上，確定通風方案采用試驗方案2，即醬油種曲四階段培養(yǎng)0 ～4 h 不通風、4 h 以后以4 ～6 m3·h-1進行持續(xù)通風的通風方案。

圖4 不同通風方案對制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

2.4 不同預處理時長對制曲菌種的影響

通過對加濕量、加濕水、通風方案的優(yōu)化，在醬油種曲四階段培養(yǎng)時間為8 h（低溫制曲工藝中大曲培養(yǎng)孢子發(fā)芽的時間）時，最高的制曲菌種孢子發(fā)芽率約為80%，尚不能達到≥85%的理想狀態(tài)。分析認為，本法直接采用在種曲機內繼續(xù)加濕通風培養(yǎng)的方案使孢子發(fā)芽，其孢子需從種曲機內的氣流中吸收水分、營養(yǎng)物質，相對于大曲培養(yǎng)時孢子與原料直接接觸而直接汲取水分、營養(yǎng)物質的方式，其吸收的速率要低于后者，故而導致即使已創(chuàng)造較好的培養(yǎng)條件，但其孢子的發(fā)芽速度仍相對較慢的問題。基于上述分析，該試驗通過以2 h 為一個梯度逐步增加四階段的預處理時長，以驗證不同預處理時間對制曲菌種的影響，試驗結果如圖5 所示。

圖5 不同預處理時長對制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

由圖5 可知，隨著醬油種曲四階段預處理時長的增加，培養(yǎng)所得的制曲菌種孢子發(fā)芽率逐漸升高。當預處理時長達到10 h 后，制曲菌種孢子發(fā)芽率均超過90%，完全達到≥85%的理想目標。綜合考慮，實際生產(chǎn)有一定波動，建議醬油種曲四階段的預處理時長控制在10 ～12 h 為宜。

2.5 制曲菌種減時制曲試驗

試驗采用上述孢子發(fā)芽率超過90%的制曲菌種進行大曲培養(yǎng)，跳過孢子吸水發(fā)芽期而直接進入生長繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競爭優(yōu)勢，抑制雜菌的污染繁殖，有利于大曲品質的提升，具體試驗結果詳見表2。

表2 制曲菌種減時制曲試驗結果匯總表

由表2 不同制曲時間大曲的質量指標與感官對比結果可知，采用本試驗的制曲菌種進行圓盤大曲的培養(yǎng)，其培養(yǎng)所得大曲均無酸曲/花曲，可以有效解決圓盤局部大曲存在酸曲/花曲的品質問題。隨著制曲時間的延長，其中性蛋白酶活力與酸性蛋白酶活力整體呈現(xiàn)上升趨勢，中性蛋白酶活力在制曲時間為38 h時最高、酸性蛋白酶活力在制曲時間為36 h 時最高。在制曲時間為36 ～38 h 時蛋白酶活力最高，對應大曲整體呈黃綠色、孢子多，但就生產(chǎn)而言，孢子數(shù)過多可能影響工人操作，同時也不便于后期清潔[8]；制曲時間為32 ～34 h 時中性蛋白酶活力均超過1 500 U·g-1、酸性蛋白酶活力均超過300 U·g-1，蛋白酶活力水平整體處于優(yōu)良水平且大曲孢子適中/不多，不會影響工人操作與后期清潔。同時，相對于常規(guī)圓盤大曲培養(yǎng)周期40 ～44 h 可縮短8 ～10 h，從而提升了產(chǎn)品質量且大大降低了原料制曲的能耗成本，本試驗醬油種曲四階段培養(yǎng)法及其圓盤制曲的生產(chǎn)工藝具有常規(guī)圓盤大曲生產(chǎn)工藝不可比擬的品質與成本優(yōu)勢。因此，采用本試驗的制曲菌種制曲的時間優(yōu)選為32 ～34 h。

3 結論

通過采用本試驗的醬油種曲四段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段后增加種曲預處理期使成熟種曲的孢子在種曲機內達到發(fā)芽的狀態(tài)而獲得制曲菌種，再使用制曲菌種進行圓盤制曲，與現(xiàn)有圓盤制曲工藝對比，得到以下結論。

（1）采用本試驗優(yōu)化后的醬油種曲四階段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段結束（72 h）后，第4階段使用10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量，并采用0 ～4 h 不通風、4 h 后以4 ～6 m3·h-1持續(xù)通風的工藝進行加濕通風培養(yǎng)，培養(yǎng)10 ～12 h后出曲而獲得制曲菌種，該方法可使制曲菌種孢子的發(fā)芽率超過90%，達到≥85%的理想目標。

（2）使用本試驗的制曲菌種進行圓盤制曲，大曲培養(yǎng)過程可跳過孢子吸水發(fā)芽期而直接進入生長繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競爭優(yōu)勢，有利于抑制雜菌的污染繁殖，其培養(yǎng)所得大曲均無酸曲/花曲，可有效解決現(xiàn)有圓盤制曲工藝中局部大曲存在酸曲/花曲的品質問題。

（3）使用本試驗的制曲菌種進行圓盤制曲，可在確保大曲品質的前提下，使其制曲時間相對于常規(guī)圓盤制曲工藝縮短8 ～10 h，從而大大降低了原料制曲的能耗成本。