陳繼榮 王佳 顳紓

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院肝膽胰外科,湖北 隨州 441300)

胰腺癌是一種高致命性的惡性腫瘤,雖然接受過包括手術(shù)切除在內(nèi)的多模式治療的患者的5年生存率超過了20%,但患者的整體生存率仍然較低〔1〕。在胰腺癌治療過程中,化學(xué)療法和放射療法的治療效果較差,因此,迫切需要新的治療策略來提高患者的生存率和預(yù)后。大量研究發(fā)現(xiàn)天然草藥具有抗腫瘤作用。金絲桃苷具有許多生物學(xué)作用,包括心肌保護(hù)、抗氧化、抗高血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用〔2～4〕。然而,尚不清楚金絲桃苷在治療胰腺癌中的作用及可能的分子機(jī)制。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中最重要的途徑之一〔5〕。核因子(NF)-κB是一種在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和血管生成中起重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在許多癌細(xì)胞中經(jīng)常被激活〔6,7〕。此外,NF-κB的活性受到PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控〔5〕。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NF-κB在胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中起關(guān)鍵作用。NF-κB可通過誘導(dǎo)生長(zhǎng)基因的表達(dá)直接刺激細(xì)胞增殖,并且NF-κB能夠通過抗凋亡作用促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)〔8〕。本研究探討金絲桃苷在體內(nèi)和體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響,并考察金絲桃苷對(duì)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,將PANC-1細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加胎牛血清(10%)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2細(xì)胞處理 將金絲桃苷(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)以1 000 mmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(DMSO,終濃度為0.1%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司)中,并保存在4 ℃下。在完全細(xì)胞培養(yǎng)基中用不同濃度(0～500 μmol/L)的金絲桃苷處理60%～70%融合的細(xì)胞72 h。用0.1%DMSO處理的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8測(cè)定 按照制造商的說明,通過CCK-8試劑盒(日本Dojindo Laboratories公司)測(cè)定細(xì)胞活力。將細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板中,每孔含有200 ml培養(yǎng)基及不同濃度〔0(對(duì)照)、50、100、200、500 μmol/L〕的金絲桃苷。然后將CCK-8溶液(10 μl)加入每個(gè)孔中,并將96板孔在37 ℃下孵育4 h。然后用酶標(biāo)儀測(cè)量不同培養(yǎng)時(shí)間段的450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD)。

1.4細(xì)胞凋亡測(cè)定 按照制造商的說明,使用膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞用不同濃度的金絲桃苷溶液〔0(對(duì)照)、50、100、200、500 μmol/L〕孵育72 h,然后用胰蛋白酶收獲細(xì)胞,在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的濃度重懸于結(jié)合緩沖液中,然后添加10 μl的Annexin V和5 μl的PI,并且將細(xì)胞在室溫下黑暗中孵育15 min。孵育后,通過貝克曼流式細(xì)胞儀Epics Altra分析凋亡細(xì)胞的百分比。

1.5Western印跡分析 將0 μmol/L和200 μmol/L金絲桃苷溶液處理的細(xì)胞在冰冷的PBS中洗滌兩次,在放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)中裂解并勻漿,然后在4 ℃下9 500 r/min離心10 min去除碎片,并根據(jù)制造商的說明使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定法確定蛋白濃度。通過在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質(zhì)(50 mg),并電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后,與以下一抗在4 ℃下過夜孵育:裂解的胱天蛋白酶(cleaved-caspase)3(1∶500稀釋)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(1∶1 000稀釋)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,1∶500稀釋)、p-Akt(1∶500稀釋,美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)、PI3K(1∶1 000稀釋)、Akt(1∶500稀釋,美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、NF-κB p65(1∶2 000稀釋,美國(guó)Abcam公司)和GAPDH(1∶1 000稀釋,美國(guó)Abcam公司)。并與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶500稀釋,美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行顯影,GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。

1.6細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定 通過孔徑為8 μm的24孔Transwell(美國(guó)Minipore公司)進(jìn)行細(xì)胞遷移測(cè)定。分別將2×105個(gè)0 μmol/L 和200 μmol/L金絲桃苷溶液處理的PANC-1細(xì)胞加入200 μl DMEM中〔含有1%胎牛血清(FBS)〕,然后添加到上室中,下室加入600 μl DMEM(含有10%FBS)。孵育24 h后,用棉簽除去上室中的未遷移的細(xì)胞,并用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,在200倍放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。將上室預(yù)先用基質(zhì)膠(美國(guó)BD Biosciences公司)包被,用于測(cè)定細(xì)胞PANC-1的侵襲能力,其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7裸鼠腫瘤異種移植模型和治療 雄性BALB/c nu/nu裸鼠(5～7周齡)購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量20～25 g。將5×106個(gè)PANC-1細(xì)胞皮下注射到裸鼠的背部建立腫瘤異種移植模型。然后,將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和金絲桃苷組(每組6只),對(duì)照組裸鼠腹腔注射200 μl 0.1%DMSO溶劑,金絲桃苷組按照30 mg/kg 的劑量注射200 μl金絲桃苷溶液,持續(xù)注射28 d。每周監(jiān)測(cè)1次腫瘤生長(zhǎng),持續(xù)4 w,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的短徑和長(zhǎng)徑,腫瘤體積=0.5×短徑2×長(zhǎng)徑。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD事后檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1金絲桃苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比,隨著金絲桃苷濃度的升高,PANC-1細(xì)胞活力顯著降低,表現(xiàn)為濃度依賴性(P<0.05)。此外,當(dāng)金絲桃苷濃度為500 μmol/L時(shí),HPDE6-C7細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2金絲桃苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組〔(1.23±0.07)%〕相比,不同濃度(50、100、200、500 μmol/L)的金絲桃苷處理PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均顯著升高〔(7.64±0.40)%、(13.26±0.70)%、(16.12±0.85)%、(21.34±1.13)%〕,并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1。Western印跡分析顯示(圖2),與對(duì)照組(1.00±0.05、1.00±0.05、1.00±0.05)相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細(xì)胞中cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(3.45±0.15、2.53±0.11,P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(0.44±0.03,P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度的金絲桃苷對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western印跡分析金絲桃苷對(duì)PANC-1細(xì)胞中cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

2.3金絲桃苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對(duì)照組〔(100.00±5.30)%〕相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞遷移率顯著降低〔(23.42±1.24)%,P<0.05〕。與對(duì)照組〔(100.00±5.30)%〕相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率顯著降低〔(17.85±0.95)%,P<0.05〕。見圖3。

圖3 Transwells法測(cè)定金絲桃苷對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4金絲桃苷對(duì)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組(1.00±0.04、1.00±0.05、1.00±0.060、1.00±0.05)相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細(xì)胞中PI3K和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低(0.24±0.01、0.17±0.01;P<0.05),Akt的磷酸化水平顯著降低(0.21±0.01;P<0.05),Akt蛋白相對(duì)表達(dá)無明顯變化(0.94±0.04;P>0.05),見圖4。

圖4 Western印跡分析金絲桃苷對(duì)PANC-1細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt和NF-κB p65表達(dá)的影響

2.5金絲桃苷對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 給藥前,對(duì)照組體質(zhì)量為(23.14±1.23)g,金絲桃苷組體質(zhì)量為(23.09±1.17)g,兩組體質(zhì)量無顯著差異(P<0.05)。在給藥28 d時(shí),對(duì)照組和金絲桃苷組體質(zhì)量無顯著差異〔(21.73±1.09) vs (21.54±1.20)g,P<0.05〕。在接種PANC-1細(xì)胞14 d后,與對(duì)照組相比,金絲桃苷組腫瘤體積顯著降低(P<0.001)。見表2。

表2 對(duì)照組和金絲桃苷組的腫瘤體積比較

3 討 論

胰腺是具有內(nèi)分泌和外分泌功能的重要器官。外分泌功能涉及消化酶向小腸的分泌,而內(nèi)分泌功能涉及激素(包括胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)抑素)的分泌〔9〕。約95%的胰腺癌靶向外分泌功能,而5%靶向內(nèi)分泌功能。前者是惡性且生長(zhǎng)迅速,而后者是良性且生長(zhǎng)緩慢。胰腺癌由于具有進(jìn)展迅速、早期癥狀少、診斷時(shí)大多處于晚期、對(duì)化學(xué)療法的反應(yīng)差等特征,導(dǎo)致患者的預(yù)后非常不理想〔10〕。

越來越多的研究表明,許多中藥可用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)〔11〕。黃酮類化合物存在于多種水果、植物來源的飲料和蔬菜中,并因其抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用而廣為人知。金絲桃苷屬于一種黃酮類化合物,具有多種生物活性,包括抗炎活性、心肌保護(hù)和抗氧化作用〔12〕。本研究結(jié)果也證實(shí),金絲桃苷可在體內(nèi)明顯抑制胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)。提示金絲桃苷可能對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用。

Bcl-2家族的蛋白質(zhì)在控制細(xì)胞凋亡途徑中起著至關(guān)重要的作用,其中Bcl-2可減少細(xì)胞凋亡,相反,Bax則誘導(dǎo)凋亡〔13〕。此外,caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的終末剪切酶,也是一種促凋亡信號(hào)分子,cleaved-caspase 3是caspase-3的活化形式。另外,caspase-3的促凋亡作用可被Bcl-2阻斷〔14～16〕。本研究結(jié)果說明,金絲桃苷可能通過調(diào)控caspase 3、Bax和Bcl-2來發(fā)揮抗凋亡作用。

胰腺癌的高致死率和高轉(zhuǎn)移性與胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力直接相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷處理降低了PANC-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。眾所周知,PI3K/Akt信號(hào)通路是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中最重要的傳導(dǎo)途徑之一〔17〕。PI3K/Akt通路在調(diào)節(jié)惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要作用已得到充分證明。AKT是P13K的下游靶標(biāo),也是一種原癌基因,活化的PI3K可激活蛋白激酶AKT并導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入分裂周期并開始增殖。本研究結(jié)果說明金絲桃苷可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來降低胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。

此外,PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以進(jìn)一步活化NF-κB〔18〕。NF-κB參與胰腺癌致癌過程的不同階段,并且在許多惡性腫瘤中均有報(bào)道〔19〕。 NF-κB誘導(dǎo)基因參與抗凋亡、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和增殖,并且在胰腺癌中起重要的調(diào)節(jié)作用〔17〕。大量天然化學(xué)活性化合物,例如紫草素、七葉皂苷、雙氫青蒿素、姜黃素、厚樸酚等都可通過調(diào)控NF-κB抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞質(zhì)中活化的NF-κB可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中并與DNA序列中的特定反應(yīng)元件結(jié)合,并控制與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)〔20〕。本研究結(jié)果說明,金絲桃苷可能通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。