鮑敏 甄海寧 何芳 丁敏 林玫 袁竹青 陳亞雋 薛欣欣

(武漢市第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,湖北 武漢 430060)

老年肺炎首發(fā)癥狀為呼吸困難、嗜睡、脫水等,嚴重危害老年人健康〔1～4〕。相關(guān)統(tǒng)計顯示,肺炎在各種致死病因中居第5位,而在老年人中致死率高居首位,因此,提高該疾病檢出率,及早作出針對治療,可提高臨床療效,減少死亡率,改善預(yù)后〔5～7〕。臨床研究認為,肺炎的發(fā)生與多種因素相關(guān),巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-2在肺炎發(fā)病過程中起重要作用,MIP-2屬于趨化因子家族成員,可活化中性粒細胞參與炎癥反應(yīng),其被證實與肺炎發(fā)病相關(guān)〔8,9〕。本研究建立肺炎老齡大鼠模型,分析下調(diào)MIP-2對肺炎老齡大鼠Toll樣受體(TLR)4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路的影響,明確MIP-2是否經(jīng)TLR4/NF-κB信號通路參與該病的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康雄性老齡大鼠60只〔北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,使用許可證號:SYXK(京)2017-0033〕,鼠齡22～25個月,平均(23.5±1.6)個月;體質(zhì)量337～352 g,平均(344.5±6.0)g。在相對濕度45%～65%、溫度(22.6±2.4)℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。本試驗獲得醫(yī)院倫理委員會審批。主要試劑:MIP-2慢病毒載體(上海吉瑪公司)、小鼠抗大鼠白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Hyclone公司)、大鼠抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+抗體(Invitrogen公司)、兔抗大鼠TLR4、NF-κB、內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(Selleck公司)。

1.2分組及建模 60只健康雄性老齡大鼠,隨機選取15只作為健康組,將剩余的45只大鼠麻醉后,固定四肢和牙齒,止血鉗夾住舌頭固定,上中牙切點懸掛,使用鈍圓針頭經(jīng)口插入氣管,滴入感染液0.28 ml/kg,保持原位20 min,以便感染液充分流入肺泡,從而引起肺部感染。第2天若老齡大鼠出現(xiàn)體溫升高、呼吸急促、弓背、四肢癱軟、飲水降低等癥狀說明肺炎老齡大鼠建模成功。最終43只老齡大鼠建模成功,隨機分為模型組15只,上調(diào)組、下調(diào)組各14只。

1.3MIP-2慢病毒載體構(gòu)建及滴定 使用GenBank查找序列獲得MIP-2序列,構(gòu)建MIP-2上調(diào)、下調(diào)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,做慢病毒滴度測定。建模完成后上調(diào)組尾部注射MIP-2上調(diào)病毒懸液10 μl,下調(diào)組尾部注射MIP-2下調(diào)慢病毒懸液10 μl。健康組、模型組大鼠不做處理,1 w后觀察老齡大鼠變化。

1.4miRNA-208轉(zhuǎn)染效率鑒定 在MIP-2轉(zhuǎn)染完成24 h后,實時熒光定量PCR檢測MIP-2轉(zhuǎn)染效率,每組隨機挑選5只老齡大鼠,麻醉后處死,迅速取肺組織,提取肺組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照,MIP-2上游序列5′-CAGAGTCCTGATGCTCCTTGC-3′,下游:5′-CCAGTCTTATCTTGG GGTCGA-3′;GAPDH上游序列5′-GAACTAAATCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.5肺系數(shù)、肺含水量檢測 各組大鼠禁食12 h,稱體質(zhì)量并記錄,麻醉大鼠,腹主動脈取血,靜置30 min,2 000 r/min離心10 min,-37 ℃保存。處死大鼠,摘取肺組織,稱質(zhì)量,計算肺系數(shù)。肺系數(shù)=〔肺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)〕×100%。取各組各3只大鼠肺組織,烘干箱烘干,稱量干肺重量,計算肺含水量。肺含水量=〔(肺質(zhì)量-干肺質(zhì)量)/體質(zhì)量〕×100%。剩余肺組織放入4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋保存,以便后續(xù)檢測。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 取出包埋后肺組織標本,流水沖洗20 min,不同濃度酒精脫水,二甲苯透明,切片機連續(xù)切片,溫水燙平,置于載玻片上,恒溫箱烘干,二甲苯脫蠟,蘇木素染色,氨水分色,自來水沖洗40 min,伊紅染色,酒精脫水,樹膠封片,置于顯微鏡下(北京萊博聯(lián)泰科技有限公司,型號:E200)觀察其肺組織病理學(xué)變化。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測炎癥因子水平 稀釋待檢血清,每孔加60 μl待測血清,封反應(yīng)孔,37 ℃溫育50 min,棄反應(yīng)液,每孔注滿洗滌液,浸泡1 min,甩干,每孔加30 μl生物素化抗體,封反應(yīng)孔,37 ℃溫育30 min,洗滌,每孔加30 μl酶標抗體,37 ℃溫育30 min,避光加顯色劑顯色15 min,加終止液,檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.8流式細胞儀檢測免疫功能因子水平 抗凝處理待測標本,分為兩管,分別加入CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體,室溫孵育30 min,兩管分別加融血劑,完全溶血后離心處理,棄上清液,洗滌液清洗,兩管分別加固定劑,加儀器緩沖液懸浮細胞,置入FACS專用管,流式細胞儀(北京中科盟科技有限公司,型號:BD FACSAriaⅡ)檢測CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.9Western印跡法檢測TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量 細胞裂解液裂解蛋白樣品,測定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),水浴加熱至蛋白變性充分,冷卻至室溫,電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)模,洗滌,加封閉液,室溫封閉60 min,加1∶1 000比例稀釋的Western一抗,4 ℃孵育60 min,回收一抗,洗滌,加1∶1 000稀釋并由辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,4 ℃孵育60 min,回收二抗,洗滌,顯色、成像,以GAPDH為內(nèi)參,計算TLR4、NF-κB蛋白表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組肺部組織病理學(xué)觀察 如圖1所示,健康組肺組織結(jié)構(gòu)正常,無病變;模型組、上調(diào)組肺組織受損,肺泡失去含氣狀態(tài),炎性浸潤明顯,纖毛上皮出現(xiàn)壞死、脫落;下調(diào)組肺泡寒氣狀態(tài)、炎性浸潤現(xiàn)象明顯改善。

圖1 各組肺部組織病理學(xué)(HE染色,×200)

2.2轉(zhuǎn)染效率鑒定 與健康組(0.27±0.06)比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組MIP-2表達量(0.62±0.11、0.87±0.15、0.38±0.09)升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(F=35.668,P<0.05,n=5);與模型組比較,上調(diào)組MIP-2表達量升高,下調(diào)組MIP-2表達量降低,有統(tǒng)計學(xué)差異(t=3.005、3.776,P<0.05),說明MIP-2轉(zhuǎn)染成功。

2.3各組肺系數(shù)、肺含水量比較 與健康組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組肺系數(shù)、肺含水量水平較高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組肺系數(shù)、肺含水量水平較高,下調(diào)組肺系數(shù)、肺含水量水平較低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組肺系數(shù)、肺含水量較低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺系數(shù)、肺含水量、炎癥因子水平、免疫功能比較

2.4各組炎癥因子水平比較 與健康組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平較高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平較高,下調(diào)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平較低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平較低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

2.5各組免疫功能比較 與健康組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組CD3+、CD4+水平較低,CD8+水平較高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組CD3+、CD4+水平較低,CD8+水平較高,下調(diào)組CD3+、CD4+水平較高,CD8+水平較低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組CD3+、CD4+水平較高,CD8+水平較低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

2.6各組TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量對比 與健康組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組TLR4、NF-κB蛋白表達量較高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組TLR4、NF-κB蛋白表達量較高,下調(diào)組TLR4、NF-κB蛋白表達量較低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組TLR4、NF-κB蛋白表達量較低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量對比

圖2 Western印跡檢測各組TLR4/NF-κB通路蛋白表達

3 討 論

肺系數(shù)、肺含水量是評估肺功能修復(fù)的重要指標,肺系數(shù)、肺含水量越低,說明其肺功能修復(fù)程度越好。有研究顯示,肺炎大鼠經(jīng)下調(diào)MIP-2干預(yù)后,肺系數(shù)降低,可能是MIP-2下調(diào)后可促進肺組織細胞修復(fù)〔10〕。本文研究表明,下調(diào)MIP-2處理肺炎老齡大鼠,能有效降低肺系數(shù)、肺含水量,從而起到肺保護作用。

MIP-2是一種堿性蛋白質(zhì),由巨噬及血管內(nèi)皮細胞分泌,屬于C-X-C亞族,可通過其趨化與活化的作用參與機體炎癥反應(yīng)〔11,12〕。相關(guān)報道顯示,MIP-2可調(diào)控IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平,從而參與肺炎的炎癥表達,當炎癥反應(yīng)誘發(fā)非功能損傷后,可趨化中性粒細胞調(diào)控促進炎癥因子表達,從而損傷機體肺功能,與本文研究結(jié)果一致〔13,14〕。還有研究認為,調(diào)控MIP-2表達可改善肺炎老齡大鼠的肺組織CD3+、CD4+等免疫因子水平,可能是MIP-2可促進T細胞的增殖與活化,從而調(diào)控機體免疫功能〔15〕。本文研究結(jié)果表明,對文中老齡大鼠MIP-2做下調(diào)處理,肺炎老齡大鼠的肺功能損傷明顯被修復(fù),表現(xiàn)為老齡大鼠肺組織炎癥反應(yīng)被抑制、免疫功能提升,分析其原因可能是MIP-2下調(diào)后因其誘發(fā)的炎癥因子的合成被抑制、免疫細胞因子合成增加,從而抑制肺組織進一步損傷,促進肺功能恢復(fù)。

TLR4/NF-κB是一種重要的信號通路,可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、先天性免疫,另在自噬中也有重要作用〔16〕。TLR4是TLR家族重要成員,是一種膜受體“門戶”,可識別各種外源性病原體,其活化后,可放大機體炎癥反應(yīng),從而加重炎癥損傷;NF-κB是調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄的因子,可抑制蛋白的結(jié)合,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,當其被激活后,可誘導(dǎo)促炎因子分泌,加重機體炎癥反應(yīng)〔17,18〕。已有研究顯示,TLR4/NF-κB信號通路參與肺組織損傷過程,如在肺炎中其被激活,可介導(dǎo)肺泡壁增厚,導(dǎo)致支氣管黏膜充血、水腫,進一步加劇肺組織損傷〔19,20〕。另有報道顯示,在肺組織損傷過程中,肺組織可經(jīng)調(diào)控MIP-2的表達,調(diào)控一些關(guān)鍵的信號通路活性,參與細胞增殖、凋亡,最終導(dǎo)致肺功能損傷〔21〕。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)下調(diào)MIP-2干預(yù)后TLR4/NF-κB信號通路活性被抑制明顯,下調(diào)MIP-2可能經(jīng)促進TLR4/NF-κB信號通路失活,從而發(fā)揮對肺組織的損傷修復(fù)作用。

綜上所述,下調(diào)MIP-2對肺炎老年大鼠進行干預(yù),能有效改善肺系數(shù)、肺含水量,減輕炎癥反應(yīng),提升機體免疫能力,其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路活性相關(guān)。