董麗娜 劉國平 劉艾芹 于磊

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

腎小球腎炎是一類常見的腎臟炎癥類疾病,其中依據(jù)病理類型又可分為膜性腎小球腎炎、系膜增生性腎小球腎炎等,且大多數(shù)患者治療后預(yù)后性較差〔1,2〕。近年來腎小球腎炎發(fā)病年齡逐漸降低,其發(fā)病率逐年加劇升高,嚴重危害著患者的身心健康〔3～6〕。腎小球腎炎特點是發(fā)病快,前期大多主要表現(xiàn)為上呼吸道感染,隨后表現(xiàn)為無癥狀性血尿等癥狀,嚴重者可發(fā)展為腎病綜合征〔7～9〕。腎小球腎炎是根據(jù)病理檢查、病理形態(tài)學(xué)診斷的腎炎,是一種以彌漫性腎小球系膜細胞增生和多種程度系膜基質(zhì)增多為特征的腎臟類炎癥〔10〕。NOD受體(NLRP)3是近些年新出現(xiàn)的有關(guān)基因表達調(diào)控的信號通路,在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著明顯的控制作用〔11〕。NLRP3的激活是腎小球腎炎病理過程中的重要步驟,研究NLRP3對于治療腎小球腎炎具有重要意義。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1是半胱氨酸蛋白酶家族中的一種,其存在于人體各種細胞質(zhì)當(dāng)中,其起著監(jiān)督炎癥發(fā)生、監(jiān)測細胞死亡的作用〔12〕。caspase-1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,病理反應(yīng)主要是提高炎性因子分泌量,使患者病情加重?；谏鲜鲅芯勘尘?在本文研究中基于NLRP3/caspase-1信號通路研究沉默免疫應(yīng)答基因(I-Aβ1)是否會優(yōu)化腎小球腎炎,對腎小球腎炎系膜細胞的增殖功能產(chǎn)生了如何影響,以便為診斷、控制、預(yù)防腎小球腎炎提供理論參考。

1 對象與方法

1.1材料 研究細胞:人系膜增生性腎小球腎炎細胞(MsPGN),購自上海雅吉生物科技有限公司,貨號:E01666,本研究操作已獲醫(yī)院倫理委員會審批同意,且嚴格按照倫理要求相關(guān)規(guī)定進行。主要試劑:RPMI1640由上海吉至生化科技有限公司提供,貨號:A90022S;胎牛血清由上海江林生物科技有限公司提供,貨號:10270-106;I-Aβ1基因由上海彩佑實業(yè)有限公司提供,貨號:YS-2191F;Trizol試劑由武漢純度生物科技有限公司提供,貨號:CD-102523GM;磷酸鹽緩沖液(PBS)由上海廣銳生物科技有限公司提供,貨號:PR694;NLRP3抗體由武漢菲恩生物科技有限公司提供,貨號:FNab10120;caspase-1抗體由武漢益普生物科技有限公司提供,貨號:ATA25867。

1.2方法

1.2.1腎小球腎炎MsPGN細胞培育 先用雙抗的RPMI1640、12%胎牛血清完全培養(yǎng)基,保存溫度為37 ℃培養(yǎng)已購買的人系膜增生性腎小球腎炎MsPGN細胞,每隔4 d替換新鮮培養(yǎng)液,當(dāng)細胞融合度達到在72%以上時,開始傳代培養(yǎng)。選擇人系膜增生性腎小球腎炎MsPGN細胞,并分為對照組、過表達組、沉默組。

1.2.2腎小球腎炎MsPGN細胞內(nèi)I-Aβ1指標(biāo)轉(zhuǎn)染 對照組不做處理,過表達組轉(zhuǎn)染I-Aβ1模擬物(mimics)上調(diào)載體,沉默組轉(zhuǎn)染I-Aβ1抑制劑(inhibitor)下調(diào)載體。I-Aβ1 mimics序列:上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′,下游5′-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3′;I-Aβ1 inhibitor序列:上游引物5′-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3′,下游5′-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3′,在轉(zhuǎn)染過程中,每組培養(yǎng)基濃度均保持在120 nmol/L。

1.2.3腎小球腎炎MsPGN細胞內(nèi)I-Aβ1指標(biāo)檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測I-Aβ1指標(biāo)。選取轉(zhuǎn)染72 h對照組、過表達組、沉默組I-Aβ1細胞,并用Trizol試劑提取,將采集到的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,配制反應(yīng)體系需選用各組2 μl的RNA樣本,0.78、1.23、4.56、0.27 μl的RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)、脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)、5 ml緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV),保持在15 ℃下,35 min。組建RT-PCR體系,其中包含1.33 μl、7.67 μl、1.2 μl、0.1 ml的無核酸酶水、cDNA、引物、探針混合物及通用混合物,小核RNA作為內(nèi)部。其中,I-Aβ1序列:上游引物5′-GGGCGGAATTGCACTTGTC-3′,下游5′-CTCAACTGGTGGTGTCGTGGAGTC-3′,反應(yīng)20 min,保持溫度在80 ℃,接著50 ℃下反應(yīng)10 min,循環(huán)40次,記錄數(shù)值,即為I-Aβ1表達量。

1.2.4雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用Targetscan靶基因軟件利用熒光素酶系統(tǒng)分析I-Aβ1和NLRP3/caspase-1信號通路的關(guān)系,檢測熒光素酶活力,將組建的NLRP3/caspase-1野生型與NLRP3/caspase-1突變型的雙熒光素酶報告載體均與I-Aβ1 mimics、I-Aβ1 inhibitor一起轉(zhuǎn)染到放置腎小球腎炎細胞的培養(yǎng)皿中,經(jīng)轉(zhuǎn)染2 d后,采集細胞,并在室溫下,進行裂解,加入熒光素酶底物,其中,內(nèi)參為熒光素酶活性,讀取、記錄熒光素酶活性數(shù)值。

1.2.5檢測腎小球腎炎系膜細胞增殖、凋亡方法 使用MTT法檢測腎小球腎炎系膜細胞增殖率,每個組胰酶進行分解,形成單細胞懸液,離心7 min,丟棄上清液,使用5 ℃的洗液,洗滌2次。取配制的單細胞懸液,加0.23 ml、0.5 ml的噻唑藍(MTT)、70%乙醇,在-24 ℃下固定,并在5 ℃下,放置12 h并離心9 min,洗液洗滌3次,置于無光環(huán)境下,用碘化丙啶液染色,用SpectraMax Paradigm卡盒式多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司 上海)測定OD值,計算增殖率。用Agilent NovoCyte 流式細胞儀(安捷倫科技公司 美國)檢測腎小球腎炎系膜細胞凋亡率。

1.2.6檢測腎小球腎炎MsPGN細胞遷移、侵襲 使用Transwell小室檢測每組腎小球腎炎MsPGN細胞侵襲數(shù),培養(yǎng)板置于Transwell小室,下室倒入120 ng/ml反應(yīng)溶液、上室倒入細胞懸液、靜放2 d,用三羥甲基丙烷溶液對培養(yǎng)板進行處理,PBS洗滌5次,每次洗滌5 min,固定并用蘇木素染色,洗滌后顯微鏡下觀察上室細胞數(shù),記錄6個視野內(nèi)細胞數(shù)的平均值,重復(fù)4次,取MsPGN細胞侵襲數(shù)平均值。用劃痕實驗檢測MsPGN細胞遷移數(shù),選取MsPGN細胞用胰蛋白酶分解,獲取細胞懸液接種到6孔板上,并用0.013 ml移液器槍頭將全部單層MsPGN細胞,從上至下畫一條劃痕,用PBS洗滌刮下細胞,向干凈培養(yǎng)基中加入3 ml的溶液,37 ℃下培育30 h,棄去培養(yǎng)液,顯微鏡下觀察并記錄4個視野平均值,重復(fù)4次,取MsPGN細胞遷移數(shù)平均值。

1.2.7檢測NLRP3/caspase-1信號通路表達量方法 采用Western印跡法檢測NLRP3/caspase-1信號通路表達量。選取系膜細胞,采集20 μg蛋白質(zhì)樣本,電泳95 min,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下,封閉處理,添加1∶1 500的TBST供給稀釋的NLRP3一抗,使用濃度為0.08%的辣根過氧化氫酶標(biāo)記caspase-1二抗,于室溫下培育,在避光環(huán)境下,采用電化學(xué)發(fā)光(ECL),進行顯色30 min,然后采用LABWORK凝膠圖像,進行掃描操作,獲取膠片,計算NLRP3、caspase-1表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗、F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1I-Aβ1轉(zhuǎn)染效率分析 如表1所示,與對照組比較,過表達組I-Aβ1表達量升高及沉默組I-Aβ1表達量降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組I-Aβ1表達量降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),說明I-Aβ1轉(zhuǎn)染成功。

表1 各組I-Aβ1轉(zhuǎn)染效率分析及系膜細胞增殖、凋亡率、MsPGN細胞遷移、侵襲數(shù)比較

2.2系膜細胞增殖、凋亡率 如表1所示,與對照組比較,過表達組24、48、72 h系膜細胞增殖率降低,凋亡率升高,沉默組24、48、72 h系膜細胞增殖率升高,凋亡率降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組24、48、72 h系膜細胞增殖率升高,凋亡率降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.3MsPGN細胞遷移、侵襲數(shù) 如表1所示,與對照組比較,過表達組MsPGN細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)增多,沉默組MsPGN細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組MsPGN細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.4雙熒光素酶報告基因結(jié)果 如表2所示,雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,與沉默組相比,過表達組NLRP3/caspase-1野生型熒光素酶活性升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);NLRP3/caspase-1突變型熒光素酶活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2 兩組熒光素酶活性比較

2.5NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達量分析 如表3所示,與對照組比較,過表達組NLRP3、caspase-1升高,沉默組NLRP3、caspase-1降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組NLRP3、caspase-1降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

臨床研究證實〔13〕,I-Aβ1基因可以調(diào)節(jié)人體大約1/4微小RNA表達,其中I-Aβ1在腎小球腎炎、腎結(jié)石、腎動脈狹窄等疾病呈現(xiàn)異常,同時與炎癥的出現(xiàn)、進展、增加、遷移有著密切聯(lián)系。I-Aβ1參加腎小球腎炎細胞的發(fā)展、產(chǎn)生、侵襲及遷移過程,多種腎臟類疾病與其表達水平關(guān)系密切,如在腎萎縮中,經(jīng)下調(diào)I-Aβ1水平增強腎臟穩(wěn)態(tài)健康細胞的抗凋亡、侵襲、遷移能力。I-Aβ1經(jīng)靶向刺激腎小球腎炎細胞大面積轉(zhuǎn)移、增殖,也可通過沉默NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達,改變MsPGN細胞的遷移、侵襲速度,進而影響腎小球腎炎系膜細胞的增殖表現(xiàn)。本研究結(jié)果表示,沉默I-Aβ1基因可改變MsPGN細胞、系膜細胞的生物活性,當(dāng)抑制I-Aβ1表達,MsPGN細胞的感染能力將會大幅度減弱,對患者病情治愈起到促進效果。

NLRP3信號通路可調(diào)控多數(shù)炎性因子、逆序靶基因的活性,刺激炎癥相關(guān)的細胞活化,致使轉(zhuǎn)錄因子加速誘導(dǎo)細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲能力,增強細胞抗凋亡作用。有研究證實〔14～16〕,NLRP3信號通路參加炎癥有關(guān)調(diào)控,經(jīng)常與促炎性因子、I-Aβ1基因等表達物質(zhì)相互反應(yīng),使炎性因子分泌增加,進而加快疾病進展。NLRP3信號通路調(diào)控靶基因細胞周期蛋白失常,可對腎小球腎炎MsPGN細胞轉(zhuǎn)移進行預(yù)測,起到對腎臟類疾病的預(yù)測作用〔17～19〕。本研究結(jié)果表示,NLRP3信號通路通過與細胞膜受體結(jié)合,刺激受體蛋白,影響炎癥細胞的分解,改變腎小球腎炎疾病進展。NLRP3信號通路可通過與I-Aβ1基因反應(yīng),刺激健康穩(wěn)態(tài)細胞信號傳導(dǎo),發(fā)揮調(diào)控細胞分化、增殖的極性作用。臨床可調(diào)控NLRP3信號通路蛋白表達,從而實現(xiàn)控制腎小球腎炎MsPGN細胞的各項能力,加速患者病情治愈。

研究證實〔20～22〕,caspase-1分布于除紅細胞外的各種細胞中,其本身是半胱氨酸蛋白酶家族的一種,形態(tài)以酶原形式存在,在腎小球腎炎細胞中起著引誘炎癥發(fā)生、促進健康穩(wěn)態(tài)細胞死亡等功能。通過本研究可發(fā)現(xiàn),caspase-1、NLRP3兩者互相協(xié)調(diào),兩者兼具促炎性。caspase-1可通過對炎性因子控制,影響患者腎小球腎炎疾病發(fā)展,同時破壞著患者腎小球腎炎系膜細胞的存活,嚴重影響著患者腎臟系膜細胞的增殖率〔23〕。caspase-1信號通路表達升高能促進病毒感染情況下免疫逃逸,因而判定caspase-1信號通路能降低腎臟中健康穩(wěn)態(tài)細胞效應(yīng)功能,成為MsPGN細胞的一種逃逸方式,進而影響腎小球腎炎的治療進展。本研究結(jié)果表示,NLRP3/caspase-1信號通路影響著腎小球腎炎的進程,NLRP3/caspase-1信號通路對腎小球腎炎耐受機制提供了臨床研究線索,對腎小球腎炎的治療、聯(lián)合治療具有重要意義。雖然本研究認為,沉默I-Aβ1基因可改變腎小球腎炎系膜增殖情況,但目前臨床上并未有研究經(jīng)其應(yīng)用于腎小球腎炎NLRP3/caspase-1信號通路的研究中,因此上述研究需后續(xù)研究進一步分析驗證。

綜上所述,基于NLRP3/caspase-1信號通路中的I-Aβ1基因互相表達、呈緊密聯(lián)系,其對腎小球腎病細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等各項指標(biāo)起到明顯的調(diào)節(jié)作用,通過調(diào)控NLRP3/caspase-1信號通路表達,從而使腎小球腎病炎癥細胞凋亡,優(yōu)化系膜細胞增殖表達,為臨床診治腎小球腎病提供理論依據(jù)。