唐楠 杜平均 楊紅亮 高學鋒 王朝陽

(河北省第七人民醫(yī)院(河北中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院),河北 定州 073000)

局部麻醉是指患者在神志清醒狀態(tài)下,將局部麻醉藥應用于身體的某一部位,使作用部位周圍的神經(jīng)感覺功能暫時阻斷,保持機體功能正?！?〕。坐骨神經(jīng)阻滯是局部麻醉之一,將局麻藥注射至坐骨神經(jīng)旁,暫時地阻滯坐骨神經(jīng)的傳導功能,達到坐骨神經(jīng)所支配區(qū)域手術無痛〔2〕。坐骨神經(jīng)由腰4至骶3前支組成,是身體最粗大的神經(jīng),位于臀大肌的深面,經(jīng)股骨大轉(zhuǎn)子和坐骨結(jié)節(jié)之間下降至大腿后面,主要支配小腿和足。坐骨神經(jīng)阻滯穿刺點常取梨狀肌與上孖肌之間,主要阻滯方法有側(cè)臥位坐骨神經(jīng)阻滯法和平臥位坐骨神經(jīng)阻滯法〔3,4〕。相對其他麻醉,局部麻醉優(yōu)勢較多,其操作簡單、方便、安全、并發(fā)癥少,麻醉狀態(tài)下患者神志清醒,對患者全身生理功能影響較小。右美托咪定(DEX)屬咪唑類衍生物,是α2-腎上腺素受體激動劑美托咪定的右旋異構(gòu)體〔5〕。DEX在臨床中的應用效果良好,DEX α2/α1受體活性較高,具有中樞性抗交感作用,可以產(chǎn)生近似睡眠的鎮(zhèn)靜作用,還具有一定的鎮(zhèn)痛、利尿、抗焦慮作用,對機體的呼吸無明顯的抑制作用,對心、腦、腎等功能器官還具有一定的保護作用,適用于手術及重癥患者的麻醉〔6〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB廣泛存在于細胞中,能和多種細胞基質(zhì)的啟動因子結(jié)合,在免疫調(diào)控、炎癥、應激反應中起重要作用。但是DEX對大鼠坐骨神經(jīng)阻滯的血流動力學、疼痛及NF-κB的研究較少,本文探討DEX對大鼠坐骨神經(jīng)阻滯的血流動力學、疼痛及NF-κB的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 36只SD大鼠,由南京君科生物工程公司提供,體質(zhì)量190～220 g,溫度(22±1) ℃,分4籠飼養(yǎng),濕度45%～55%,大鼠活動飲水自由,術前禁食12 h,自由進水,嚴格按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗,實驗方案經(jīng)河北省醫(yī)學院動物實驗倫理委員會批準(批準編號為2018012),動物許可證號:SYXK(蘇)2018-0010。

1.2藥物、試劑與儀器 DEX(深圳海思安生物技術公司)、羅哌卡因(北京德航五洲科技)、臺式離心機(上海力申科學儀器制造廠)酶標儀(上海研卉生物科技)、化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海易孛特生命科學公司)、電泳儀(上海百賽生物技術公司)、BCA蛋白檢測試劑(上海雅吉生物科技公司)

1.3建模及分組 分組:用隨機法將36只大鼠分為假手術(SO)組、DEX低濃度(DLC)組、高濃度(DHC)組、羅哌卡因(ROP)組。建模:采用戊巴比妥鈉經(jīng)大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉完全后,將大鼠固定于鼠架臺上,俯臥位,備皮,消毒。操作的整個過程中,嚴格無菌,在大鼠右側(cè)股后外側(cè)行縱行切口,自股二頭肌與半腱肌、半膜肌之間剪開結(jié)締組織,鈍性分離股二頭肌與半腱肌,暴露坐骨神經(jīng)〔7〕。

1.4干預方法 建模成功后,DLC組和DHC組分別給予DEX10、20 μg/kg注射到大鼠坐骨神經(jīng)周圍,ROP組給予0.5%羅哌卡因0.3 ml注射到大鼠坐骨神經(jīng)周圍,SO組給予等容量生理鹽水。

1.5大鼠行為學觀察

1.5.1機械性縮足反射閾值(PWT)檢測 將各組大鼠放入籠內(nèi),籠內(nèi)箱底為金屬網(wǎng)板的丙烯酸,大鼠適應30 min左右,纖維絲持續(xù)刺激大鼠后足,每次重復測量3次,取平均值,為了避免組織損傷,刺激時間為(5±1)s,觀察大鼠反應,記錄大鼠受襲擊后是否出現(xiàn)撤足或者舔足反應,出現(xiàn)則為陽性,記錄陽性反應時,最小纖維絲刺激力大鼠后肢PWT。

1.5.2大鼠后足伸姿推力(EPT)測量 將大鼠直立上提,保持后足伸展姿勢,以便遠端足趾和足尖支撐體重,然后置于電子稱上方,大鼠后足伸展所顯示的克數(shù)即為大鼠EPT,推力變小表明因運動阻滯導致伸肌收縮力減弱。

1.6血流動力學指標檢測 大鼠麻醉后,將股動脈插管通過壓力傳感器鏈接于生物信號采集處理系統(tǒng),將電極插入動物四肢皮下,連接好導線,經(jīng)過左心室插管記錄左心室收縮曲線,計算左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP),左心室最大收縮速率(+dp/dt),左心室最大舒張速率(-dp/dt)。

1.7標本采集 用1%戊巴比妥鈉麻醉處死各組大鼠,取各組注射部位坐骨神經(jīng),用4%多聚甲醛液固定24 h。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組坐骨神經(jīng)病理學變化 取出已經(jīng)固定好的坐骨神經(jīng),石蠟包埋,梯度酒精脫水,透明,浸蠟包埋,取出蠟塊,切片取4 μm厚度。用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,水洗5 min,置于蘇木素染色10 min,沖洗,置于伊紅染色10 min,再次梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察坐骨神經(jīng)排列及形態(tài)、軸突等。

1.9TUNEL法檢測各組坐骨神經(jīng)凋亡 取坐骨神經(jīng)組織,切片浸入TUNEL反應液中,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。過氧化氫沖洗淬滅酶活性,后聯(lián)合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯胺覆蓋,光學高倍顯微鏡下進行觀察凋亡細胞核呈現(xiàn)棕黃色,隨機選擇5個視野下的細胞觀察凋亡率。

1.10Western印跡檢測坐骨神經(jīng)中NF-κB、白細胞介素(IL)-6水平 坐骨神經(jīng)組織樣本經(jīng)液氮研磨之后,加入400 μl裂解液,充分混勻。4 ℃放置60 min后,4 ℃離心15 min后收集上清。將獲得的總蛋白用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測,測定蛋白濃度。100 ℃沸水加熱處理 5 min,使蛋白充分變性,離心5 min,取上清備用。分離膠與5%濃縮膠,每孔上樣60 μg,恒壓100 V跑電泳90 min,待溴酚藍到達膠底部時,停止電泳。恒壓將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉的封閉液,封閉轉(zhuǎn)印膜1 h,然后TBST洗3次,5 min/次。加入一抗NF-κB(1∶500)、IL-6(1∶500)過夜孵育。TBST漂洗3次后,用辣根過氧化物酶耦聯(lián)二級抗體山羊抗兔 IgG(1∶5 000)在室溫下再次孵育1 h,TBST漂洗3次后,浸入電化學發(fā)光(ECL)工作液,檢測,顯色等步驟,成像系統(tǒng)對印跡條帶的光密度進行分析。GAPDH作為內(nèi)參。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析或重復測量方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組PWT比較 與SO組相比,ROP組、DLC組及DHC組在0～2.0 h各時間段PWT值均明顯升高(P<0.05);與ROP組相比,DLC組及DHC組0.5～3.0 h時間段PWT值均明顯升高(P<0.05),DHC組0.5～3.5 h各時間段PWT值明顯高于DLC組(P<0.05),見表1。

表1 各組PWT比較

2.2各組EPT比較 與SO組相比,ROP組、DLC組及DHC組0～2.0 h各時間段EPT值明顯降低(P<0.05);與ROP組相比,DLC組及DHC組0.5～3.0 h時間段EPT值明顯降低(P<0.05),DHC組0.5～3.5 h時間段EPT值明顯低于DLC組(P<0.05),見表2。

表2 各組EPT水平比較

2.3各組血流動力學比較 與SO組相比,ROP組、DLC組及DHC組LVEDP、LVSP、+dP/dt、-dP/dt明顯升高(P<0.05);與ROP組相比,DLC組、DHC組LVEDP、LVSP、+dP/dt、-dP/dt明顯升高(P<0.05);與DLC組相比,DHC組血流動力學指標顯著升高(P<0.05),見表3。

表3 各組血流動力學及炎性指標比較

2.4各組炎性因子NF-κB、IL-6蛋白表達 與SO組相比,ROP組、DLC組及DHC組坐骨神經(jīng)組織中NF-κB、IL-6蛋白表達明顯升高(P<0.05);與ROP組相比,DLC組和DHC組NF-κB、IL-6蛋白表達明顯下降(P<0.05);DHC組坐骨神經(jīng)組織中NF-κB、IL-6蛋白表達明顯低于DLC組(P<0.05),見表3、圖1。

圖1 各組NF-κB、IL-6蛋白表達

2.5各組坐骨神經(jīng)HE染色結(jié)果 SO組坐骨神經(jīng)外膜完整,神經(jīng)纖維排列緊密、整齊,形態(tài)正常,染色均勻,軸突及髓鞘結(jié)構(gòu)清晰;ROP組部分坐骨神經(jīng)纖維排列紊亂、連續(xù)性中斷,部分軸突、神經(jīng)鞘膜水腫;DLC組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂、連續(xù)性中斷現(xiàn)象明顯減少,軸突水腫,神經(jīng)纖維髓鞘水腫; DHC組坐骨神經(jīng)纖維排列較整齊,神經(jīng)軸突輕度水腫,見圖2。

圖2 各組坐骨神經(jīng)病理變化(HE染色,×200)

2.6各組坐骨神經(jīng)細胞凋亡率的比較 與SO組坐骨神經(jīng)細胞凋亡率〔(6.91±1.48)%〕相比,ROP組〔(26.31±1.39)%〕明顯升高(P<0.05);與ROP組相比,DLC組〔(19.34±1.78)%〕明顯下降(P<0.05);DHC組坐骨神經(jīng)細胞凋亡率〔(13.25±1.57)%〕明顯低于DLC組(P<0.05),見圖3。

圖3 各組坐骨神經(jīng)細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

3 討 論

局部麻醉相比全身麻醉具有一定獨特性,局麻藥的作用一般局限于給藥部位,且隨藥物擴散而迅速消失。研究表明,DEX有較好的降低應激反應、維持血流動力學穩(wěn)定,預防術后譫妄的效果,能夠有效改善術中缺血對器官組織的損傷,DEX可能通過抑制腎上腺素的釋放,調(diào)節(jié)機體免疫〔8～10〕。

血流動力學指標是真實反映機體應激狀況的有效評價指標,能較好地反映心臟的功能,LVSP主要反映心肌的收縮能力,LVEDP代表左心室前負荷,間接反映心室的舒張順應性。+dp/dt在一定程度傷反映室壁張力的變化速度,它受心臟的前后負荷影響較大,分別反映收縮期和舒張期心肌的收縮功能。本研究結(jié)果提示,DEX可以改善血流動力學的異常,維持血流動力學的穩(wěn)定。楊百武等〔11〕通過對子宮切除術的患者進行研究發(fā)現(xiàn),通過應用DEX,患者的血流動力學更加穩(wěn)定,可以降低應激反應,減少麻醉藥的用量,術后患者效果也較好。DEX主要作用藍斑核,可抑制去甲腎上腺素的釋放,終止疼痛信號的傳導。藍斑作為該系統(tǒng)的中樞位點,受到DEX作用后產(chǎn)生類似自然睡眠,起到抗焦慮鎮(zhèn)靜作用,同時抑制了交感神經(jīng)興奮和腎上腺髓質(zhì)興奮,減少了去甲腎上腺素和腎上腺素的釋放,使血流動力學更加穩(wěn)定〔7〕。

術后疼痛可刺激機體呈現(xiàn)應激狀態(tài)并分泌大量糖皮質(zhì)類與兒茶酚胺類激素,進而誘發(fā)多種炎性因子釋放,術后疼痛本身亦會產(chǎn)生大量炎性因子。DEX最初運用于臨床時,僅運用其鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)其還有抗炎、抗焦慮等作用,因此DEX在臨床應用的也逐漸增多。DEX可能通過維持顱內(nèi)壓平衡,減少腦代謝、腦血流,減少炎癥介質(zhì)及神經(jīng)內(nèi)分泌激素釋放,降低腦耗氧量,從而保護神經(jīng)系統(tǒng)〔12〕。研究表明,DEX具有抗炎作用,能夠抑制TNF-α、IL-6等多種炎性因子的產(chǎn)生,并對心腦肝等器官有保護作用〔13〕。NF-κB的過度活化可上調(diào)多種炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄,間接激活機體的特異性免疫反應,造成組織和器官的功能紊亂。夏繼輝等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠體內(nèi)的炎性因子NF-κB、IL-6水平明顯升高,而經(jīng)過DEX干預后膿毒癥大鼠體內(nèi)的炎性因子水平明顯下降,減輕炎性因子介導對心臟的損傷,維持大鼠體內(nèi)血流動力學穩(wěn)定,說明DEX不但可以抑制炎性因子的表達還可以維持血流動力學穩(wěn)定。DEX抑制突觸末梢神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用。研究表明,DEX可以抑制巨噬細胞和單核細胞炎性因子IL-6、NF-κB等分泌,具有抗炎癥反應和抗交感神經(jīng)活性作用,可以明顯抑制炎癥反應。本研究結(jié)果表明,DEX可抑制炎性水平。

DEX用于神經(jīng)阻滯是近年來提出的一個比較新穎的藥物,其能通過激動脊髓突觸前膜和后膜α2受體,從而使細胞產(chǎn)生超級化,抑制疼痛信號。有學者認為促炎因子的釋放可能和疼痛有關。研究發(fā)現(xiàn),在局麻藥中加入DEX,發(fā)現(xiàn)其阻滯時間可以延長,且所有患者在術中及術后均未出現(xiàn)嚴重的不良反應〔15〕。王玉嘉等〔16〕發(fā)現(xiàn),DEX聯(lián)合阿片類藥物舒芬太尼用于剖宮產(chǎn)術后的鎮(zhèn)痛,不僅可以顯著延長鎮(zhèn)痛時效,還可以明顯的降低產(chǎn)后抑郁評分(EPDS),減輕患者產(chǎn)后抑郁程度,降低產(chǎn)后抑郁的發(fā)生率,減少陣痛藥物使用劑量。本研究結(jié)果說明,經(jīng)過DEX干預后神經(jīng)阻滯在感覺和運動方面均有延長,其中感覺延長時間更為明顯。研究證實,DEX可以預防麻醉藥如異氟烷、氯胺酮等所導致的中樞神經(jīng)毒性,減輕神經(jīng)元凋亡,保護腦功能〔17,18〕。有研究〔19〕發(fā)現(xiàn),DEX可以通過抑制 p38MAPK 信號通路的激活,對神經(jīng)細胞凋亡進行抑制,從而減輕了丁哌卡因的脊髓神經(jīng)毒性。本研究與上述研究一致。

綜上,DEX維持坐骨神經(jīng)阻滯大鼠的血流動力學穩(wěn)定,抑制NF-κB、IL-6炎性因子表達,發(fā)揮陣痛效果,對神經(jīng)細胞具有保護機制。