張彩霞 周泰冰 陳丹丹 接琳琳 盧強(qiáng) 吳君

(山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校,山東 煙臺 264199)

阿爾茨海默病(AD)是一種隨著年齡增長認(rèn)知功能逐漸下降最終導(dǎo)致死亡的神經(jīng)退行性疾病,好發(fā)于65歲以上的老年人〔1〕,目前尚無有效的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為AD的認(rèn)知功能減退主要與老年衰憊、腎精失充有關(guān)。補(bǔ)腎類中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢,在延緩腦組織的衰老、改善學(xué)習(xí)記憶障礙等能力方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢〔2〕。研究表明,連續(xù)補(bǔ)腎益智方灌胃的AD模型鼠,腦內(nèi)興奮性氨基酸明顯降低,而抑制性氨基酸γ氨基丁酸和甘氨酸的含量升高,有預(yù)防及緩解記憶力衰退的功效〔3〕。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明,補(bǔ)腎益智方能顯著提高AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔4〕。生長相關(guān)蛋白(GAP)-43和神經(jīng)生長因子(NGF)均是與軸突生長、突觸可塑性和神經(jīng)修復(fù)密切相關(guān)的基因〔5,6〕。本研究擬通過觀察補(bǔ)腎益智方對7月齡 SAMP8 小鼠海馬和內(nèi)嗅皮層中GAP-43和NGF表達(dá)的影響,研究中藥復(fù)方對神經(jīng)元的作用機(jī)制,以期為中醫(yī)中藥防治AD的臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 7月齡快速老化模型SAMP8雄性小鼠90只,7月齡雄性SAMR1小鼠30只,均購自北京華阜康生物科技有限公司,動物許可證號 SCXK(京)2019-0008。SPF級,動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)良好,自然光照,室溫(22±2)℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行灌胃試驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎益智方:熟地黃15 g、枸杞子20 g、山茱萸12 g、鹽益智仁6 g、丹參15 g、當(dāng)歸10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、遠(yuǎn)志6 g等,以上藥物經(jīng)山東天江藥業(yè)制成免煎顆粒。補(bǔ)腎益智方劑量設(shè)定根據(jù)成人臨床給藥劑量1.34 g/(kg·d)的2倍、4倍確立〔7〕,低劑量〔2.68 g/(kg·d)〕、高劑量補(bǔ)腎益智方藥液終濃度〔5.36 g/(kg·d)〕連續(xù)灌胃6 w。藥液配制完成后放置于4 ℃冰箱冷藏備用,用前37 ℃溫水浴后搖勻。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗GAP-43多克隆抗體(ab75810)和兔抗NGF多克隆抗體(ab52918)均購自Abcam公司;熒光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG(111-095-003)購自美國Jackson Immuno Research;TRIzol(15596-026)購自美國Invitrogen公司;cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036B)購自日本TaKaRa,;One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)Kit Ⅱ(SYBR Green)購自日本TaKaRa,生產(chǎn)批號:RR086B。

1.4給藥與取材 將SAMP8小鼠隨機(jī)分成3組:模型組、補(bǔ)腎益智方低劑量組和補(bǔ)腎益智方高劑量組。對照組為同月齡SAMR1小鼠。補(bǔ)腎益智方低劑量組和高劑量分別給予小鼠終濃度為2.68 g/(kg·d)和5.36 g/(kg·d)補(bǔ)腎益智方藥液連續(xù)灌胃42 d。模型組和對照組均給予等量生理鹽水灌服,烏拉坦麻醉。隨機(jī)選取部分小鼠經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定,取小鼠大腦,制作石蠟切片,進(jìn)行免疫熒光染色。一部分剝離小鼠海馬和內(nèi)嗅皮層,TRIzol勻漿器冰上充分勻漿,提取總RNA,一部分提取小鼠海馬和內(nèi)嗅皮層總蛋白。

1.5免疫熒光染色 切片脫蠟,封閉內(nèi)源性過氧化物酶;37 ℃封閉非特異性抗原。甩去多余血清,滴加一抗兔抗GAP-43(1∶150)或兔抗NGF(1∶200),將切片置于濕盒,孵育過夜(4 ℃)。滴加熒光二抗(1∶400),37 ℃,避光孵育50 min;4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染,將切片置于暗盒,孵育5 min。熒光防淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。

1.6RT-PCR 分別提取小鼠海馬和內(nèi)嗅皮層總RNA,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)步驟參照Zhou等〔8〕。擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃,5 min;變性95 ℃,15 s,58 ℃退火20 s,延伸72 ℃,40 s,進(jìn)行40循環(huán);95 ℃,8 min。引物序列:GAP-43上游引物:5′-GCTGTGCTGTATGAGAAGAACC-3′,下游:5′-AATTTTGGT-CGCAGCCTTATGA-3′;NGF上游引物:5′-GTCTGG-GCCCAATAAAGGTTTT-3′,下游:5′-GAAGTTTAGT-CCAGTGGGCTTC-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5′-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3′,下游:5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′。

1.7Western印跡檢測 分別提取小鼠海馬和內(nèi)嗅皮層組織總蛋白。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉溶液室溫封閉60 min;一抗(兔抗GAP-431∶15 000或兔抗NGF1∶12 000),4 ℃過夜;羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃搖床孵育55 min;電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)3 min,暗室膠片曝光。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。采用ImageJ圖像分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1GAP-43定位于海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)且補(bǔ)腎益智方灌胃后表達(dá)升高 各組大腦切片的海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)中均可檢測到GAP-43陽性細(xì)胞。與對照組比較,模型組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,補(bǔ)腎益智方低劑量組與高劑量組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05)。與補(bǔ)腎益智方低劑量組比較,補(bǔ)腎益智方高劑量組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中GAP-43平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)雖有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1、圖2、表1、圖3、圖4。

表1 各組海馬區(qū)及內(nèi)嗅皮層GAP-43免疫陽性細(xì)胞平均光密度值、mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖1 各組海馬區(qū)GAP-43表達(dá)(免疫熒光,×400)

圖2 各組內(nèi)嗅皮層GAP-43表達(dá)(免疫熒光,×400)

1～4:對照組、模型組、補(bǔ)腎益智方低劑量組、補(bǔ)腎益智方高劑量組;圖4同

圖4 Western印跡檢驗(yàn)各組內(nèi)嗅皮層GAP-43和NGF蛋白表達(dá)

圖5 各組海馬區(qū)NGF表達(dá)(免疫熒光,×400)

2.2NGF定位于海馬區(qū)且補(bǔ)腎益智方灌胃后表達(dá)升高 補(bǔ)腎益智方灌胃42 d后,各組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層切片中均可檢測到NGF陽性細(xì)胞。與對照組比較,模型組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,補(bǔ)腎益智方低劑量組與高劑量組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05)。與補(bǔ)腎益智方低劑量組相比,補(bǔ)腎益智方高劑量組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達(dá)雖有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖3～圖6、表2。

表2 各組海馬區(qū)及內(nèi)嗅皮層NGF免疫陽性細(xì)胞平均光密度值、mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖6 各組內(nèi)嗅皮層NGF表達(dá)(免疫熒光,×400)

3 討 論

AD可影響人體多個系統(tǒng),隨著病情加重,會導(dǎo)致患者失去自主生活能力并帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥,最終死亡。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)嗅皮層是AD患者大腦中最早最明顯的受損區(qū),AD早期內(nèi)嗅皮層中會出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)纖維纏結(jié)、淀粉樣斑塊和突觸損傷丟失等現(xiàn)象,隨后逐漸擴(kuò)展至海馬等周圍結(jié)構(gòu)〔9〕。內(nèi)嗅皮層連接海馬與新皮層,被稱為皮層記憶的樞紐,內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元在記憶的恢復(fù)中起著重要作用〔10〕。神經(jīng)元的記憶功能活動需要依靠突觸連接來實(shí)現(xiàn),因此突觸的損傷或缺失是影響認(rèn)知功能神經(jīng)生物學(xué)的重要因素〔11〕。

GAP-43是一種在大腦海馬中表達(dá)豐富的磷蛋白,可影響神經(jīng)發(fā)育和突觸重塑。在正常海馬和記憶相關(guān)區(qū)域,GAP-43高水平表達(dá),而GAP-43缺失會導(dǎo)致小鼠空間記憶功能障礙〔12〕。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受損時,損傷部位周圍的神經(jīng)元可通過反應(yīng)性軸突和側(cè)枝再生進(jìn)行補(bǔ)償。受損區(qū)域中的GAP-43表達(dá)水平隨損傷修復(fù)時間的增加而增加,然后逐漸降低。因此,GAP-43被認(rèn)為是研究神經(jīng)可塑性、修復(fù)和再生的首選探針〔13〕。本實(shí)驗(yàn)兩組海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中均檢測到GAP-43陽性細(xì)胞的存在。

歷代名老中醫(yī)常以“腎-髓-腦”為軸線,以補(bǔ)腎為先的理念論治AD臨床證明可取得滿意療效。補(bǔ)腎益智方中枸杞子、熟地黃和山茱萸可補(bǔ)腎填精,郁金、石菖蒲和遠(yuǎn)志可活血化痰開竅。因此補(bǔ)腎益智方具有補(bǔ)腎益氣、活血健腦和開竅醒神的功效,與AD發(fā)病機(jī)制相契合〔14〕。本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)腎益智方飲片為原料,通過現(xiàn)代化制藥技術(shù)制成免煎顆粒。免煎顆粒不但方便服用而且可以明確地控制質(zhì)量,能夠很好保留中藥飲片的藥性和藥效,在一定程度可以作為中藥水煎劑的替代〔15〕。臨床實(shí)踐證明,補(bǔ)腎益智方在老年遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙方面有療效〔16〕。前期水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益智方能有效改善6月齡SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔17〕。本研究結(jié)果提示,補(bǔ)腎益智方免煎顆?？缮险{(diào)GAP-43的表達(dá)。GAP-43在大腦突觸功能的維持和神經(jīng)處理中起關(guān)鍵作用,出生1 w時在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)最高,成年之后除了海馬和新皮質(zhì)區(qū)表達(dá)較高,腦部其他區(qū)域表達(dá)較低〔18〕。本研究結(jié)果說明,AD的記憶喪失可能與突觸的修復(fù)或神經(jīng)功能障礙有關(guān)。適度GAP-43蛋白表達(dá),有利于記憶增強(qiáng),而過度的GAP-43表達(dá)反而有可能損傷記憶〔19〕。經(jīng)過補(bǔ)腎益智方灌胃治療42 d后,GAP-43蛋白在海馬的表達(dá)明顯高于模型組,這提示上調(diào)的GAP-43可能有利于海馬區(qū)突觸修復(fù)和神經(jīng)元再生,進(jìn)而有改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。

NGF廣泛存在于成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng),是一種十分重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,有促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、分化、成熟、再生和突觸可塑性的作用〔20〕。當(dāng)皮質(zhì)和海馬區(qū)NGF的供應(yīng)量減少時,基底前腦膽堿能神經(jīng)元形態(tài)和功能出現(xiàn)障礙,導(dǎo)致AD認(rèn)知功能下降〔21〕。本研究結(jié)果提示,補(bǔ)腎益智方可上調(diào)SAMP8小鼠海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中NGF,可能與神經(jīng)元或突觸的修復(fù)有關(guān)。在缺血腦卒中動物模型中,NGF過表達(dá)可通過上調(diào)GAP-43,使GAP-43穩(wěn)定性提高,誘導(dǎo)神經(jīng)元形態(tài)和功能恢復(fù),進(jìn)而緩解動物的認(rèn)知障礙〔22〕。由此推測,補(bǔ)腎益智方也可能通過上調(diào)NGF,提高GAP-43神經(jīng)元和突觸的修復(fù)作用,進(jìn)而改善SAMP8小鼠的認(rèn)知障礙。本研究發(fā)現(xiàn),不同劑量補(bǔ)腎益智方在GAP-43、NGF蛋白和mRNA表達(dá)方面尚未發(fā)現(xiàn)明顯變化,分析原因可能與所選劑量或?qū)嶒?yàn)動物月齡等因素有關(guān)。

綜上所述,補(bǔ)腎益智方免煎顆?？赏ㄟ^改善SAMP8小鼠海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮層中GAP-43、NGF蛋白和mRNA表達(dá),減輕其空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷,這可能與其調(diào)控神經(jīng)元修復(fù)和軸突可塑性密切相關(guān),具體機(jī)制有待深入研究。