桂林 何文林 黃遠(yuǎn)帥 涂業(yè)桃 田剛

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科,四川 瀘州 646000;2瀘州市疾病預(yù)防控制中心;3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部)

現(xiàn)今對(duì)于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染中老年患者的治療方式保持與成人治療一致性原則,主要通過(guò)選擇不同機(jī)制藥物聯(lián)合治療進(jìn)行HIV高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療〔1〕。相比于年輕群體,中老年群體機(jī)體各功能均有所退化,T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低,因此更容易遭受病毒侵襲,HIV感染率及死亡率更高〔2〕。Liu等〔3〕研究表明,轉(zhuǎn)錄本(NEAT)-1在HIV感染靶細(xì)胞過(guò)程中起重要作用,并且在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控病毒的表達(dá),NEAT-1與HIV感染具有密切聯(lián)系。淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡受體(PD)-1通過(guò)與其配體PD-1L結(jié)合能夠負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,HIV感染可能通過(guò)調(diào)節(jié)PD-1/PD-1L的表達(dá)來(lái)影響淋巴細(xì)胞的成熟〔4〕。任園園等〔5〕研究顯示,解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17是新近發(fā)現(xiàn)的ADAM蛋白家族的成員,可在大多數(shù)組織中表達(dá),并在炎癥、腫瘤生長(zhǎng)和血管生成過(guò)程中顯著上調(diào),在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但有關(guān)ADAM17在HIV感染患者機(jī)體中的表達(dá)及與病情發(fā)展的關(guān)系研究甚少。本文旨在探究NEAT-1、PD-1、ADAM17在中老年HIV感染患者中的表達(dá)及與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性,為HIV感染治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年1月至2020年1月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的67例中老年HIV感染患者作為HIV組,病程(20.29±3.21)個(gè)月;感染途徑:同性傳播15例(22.39%)、異性傳播30例(44.78%)、注射毒品17例(25.37%)、其他5例(7.46%);合并糖尿病21例(31.34%)、高血壓19例(28.36%)、高脂血癥27例(40.30%)。選取在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的53例中老年健康體檢者作為對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比,HIV組年齡50～80歲,對(duì)照組年齡50～75歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),研究患者及家屬均已簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組一般資料

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):HIV組入組患者符合《中國(guó)艾滋病診療指南(2018版)》〔6〕中對(duì)HIV感染診斷標(biāo)準(zhǔn),患者經(jīng)檢查均為HIV感染癥狀,且對(duì)照組均身體健康無(wú)不良癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn):合并腎臟嚴(yán)重?fù)p害者、惡性腫瘤、精神疾病、心臟疾病、心腹功能嚴(yán)重異常者、自身免疫系統(tǒng)疾病者、嚴(yán)重心血管疾病患者、依從性差及不配合治療者。

1.3NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA檢測(cè) 抽取所有患者清晨空腹靜脈血5 ml,以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心處理10 min,在-50 ℃環(huán)境下保存。采用熒光定量PCR檢測(cè)NEAT-1、PD-1、ADAM17,在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,提取各組細(xì)胞總RNA,在測(cè)量濃度后,放置在-80 ℃保存,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄盒步驟進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)條件:85 ℃,2 min;85 ℃,20 min;80 ℃,20 s;30個(gè)循環(huán),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。引物序列:NEAT-1上游:5′-ACATTTTCCACCTCTGCTTC-3′,下游:5′-TGGCTTCACGTTAGTGACTG-3′;miR-155上游:5′-ACATGTTCCATTCCCCTTTC-3′,下游:5′-CACGTTTATGGCTC TAGTGG-3′;ADAM17上游:5′-ACATCCTCTTCCTTGCATTC-3′,下游:5′-TGAGTTTGCCGTGATCACTG-3′;利用2-△△Ct法計(jì)算血清NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA。

1.4T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用抗凝全血標(biāo)本,在Falcon流式樣管內(nèi)置入30 μl T淋巴細(xì)胞亞群試劑及50 μl全血,充分混合均勻,放置室溫陰暗處20 min后加入10倍稀釋流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)溶血素500 μl,放置室溫陰暗處10 min。應(yīng)用muleiTEST自動(dòng)軟件獲取淋巴細(xì)胞,并分析T淋巴細(xì)胞免疫報(bào)表,報(bào)告顯示CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞成百分率及CD4+/CD8+比值。

1.5病情嚴(yán)重程度分級(jí) 依據(jù)《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》WS293-2019〔7〕,CD4+細(xì)胞≥500個(gè)/μl為無(wú)免疫缺陷,350～499個(gè)/μl為輕度免疫缺陷,200～349個(gè)/μl為中度免疫缺陷,<200個(gè)/μl為重度免疫缺陷。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1NEAT-1、PD-1、ADAM17水平比較 如表2所示,與對(duì)照組相比,HIV組NEAT-1、ADAM17水平均顯著降低,PD-1顯著升高(P<0.05)。

表2 各組NEAT-1、PD-1、ADAM17及T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.2T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 如表2所示,與對(duì)照組相比,HIV組CD4+細(xì)胞降低,CD8+細(xì)胞升高,CD4+/CD8+細(xì)胞比值降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3中老年HIV感染影響因素的多元Logistic回歸分析 如表3所示,以患者發(fā)生HIV感染作為因變量(輕度=0,中、重度=1),將NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+細(xì)胞作為自變量,納入二分類多因素Logistic回歸分析,結(jié)果表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+細(xì)胞為影響中老年HIV感染的顯著因素(P<0.05)。

表3 發(fā)生中老年HIV感染影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4NEAT-1、PD-1、ADAM17與T淋巴細(xì)胞亞群之間相關(guān)性分析 NEAT-1與CD4+/CD8+比值呈正相關(guān)(r=0.022,P=0.004);PD-1與CD4+/CD8+比值之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.441,P=0.001);ADAM17與CD4+/CD8+比值呈正相關(guān)(r=0.362,P=0.001)。

3 討 論

因HIV感染引起的機(jī)體免疫功能缺陷臨床無(wú)法治愈,可通過(guò)藥物治療控制進(jìn)展,危險(xiǎn)性極高〔8〕。根據(jù)研究調(diào)查,目前全球范圍內(nèi)HIV患病率與死亡率都逐年增長(zhǎng),其我國(guó)表明現(xiàn)存活HIV攜帶者與HIV患者約有85萬(wàn)例,死亡率累積超過(guò)30萬(wàn)例〔9〕。HIV主要傳播途徑為血液、性接觸傳播及母嬰傳播〔10〕。研究表明,HIV感染機(jī)體后,存在細(xì)胞因子的飄移現(xiàn)象而隨著病程的發(fā)展,細(xì)胞因子的表達(dá)呈進(jìn)行性失調(diào)對(duì)疾病的預(yù)后有重要影響〔11〕。本研究表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均與中老年HIV感染及T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān),可用作于臨床預(yù)測(cè)中老年HIV感染的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

在機(jī)體免疫系統(tǒng)功能中主要為T(mén)淋巴細(xì)胞由CD4+、CD8+兩群細(xì)胞組成,其CD4+主要為輔助在HIV感染中的主要靶細(xì)胞,當(dāng)人體免疫功能出現(xiàn)缺陷的主要原因?yàn)镃D4+數(shù)量及功能降低從而引起HIV感;CD8+屬于抑制T淋巴細(xì)胞,在控制HIV復(fù)制過(guò)程中起到重要作用;且CD4+/CD8+比值可有效反映中老年HIV疾病狀況,并可作為評(píng)價(jià)HIV感染者免疫系統(tǒng)損害狀況最重要的指標(biāo)〔12〕。

NEAT-1是在細(xì)胞核內(nèi)一種被稱為旁斑的結(jié)構(gòu)上,且對(duì)旁斑結(jié)構(gòu)的形成及維持具有重要關(guān)系,其旁斑主要將持編輯的RNA滯留在細(xì)胞核內(nèi),因此使基因的表達(dá)水平降低〔13〕。根據(jù)Peterson等〔14〕研究表明,NEAT-1表達(dá)降低可導(dǎo)致病毒的產(chǎn)生,其機(jī)制主要是增加HIV-1 mRNA在細(xì)胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及出核。張喜等〔15〕研究顯示NEAT-1在發(fā)現(xiàn)時(shí)主要作用為肺癌的預(yù)后指標(biāo),其與許多實(shí)體腫瘤有所關(guān)聯(lián),NEAT-1在細(xì)胞核中參與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的形成及基因表達(dá)過(guò)程。隨著深入研究發(fā)現(xiàn)NEAT-1與一些病毒感染相關(guān),在腎綜合征出血熱患者的腎組織中高表達(dá)〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn),NEAT-1在中老年HIV表達(dá)量降低,顯示NEAT-1的表達(dá)與中老年HIV感染有著相對(duì)關(guān)聯(lián),并對(duì)HIV疾病發(fā)展有著重要影響,但機(jī)制表達(dá)尚不清楚,需進(jìn)一步研究分析。

共刺激分子在T淋巴細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,B7-H1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類免疫抑制性共刺激分子,與相應(yīng)受體PD-1結(jié)合后能夠抑制T淋巴細(xì)胞的成熟、削弱T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能〔17〕。多種病毒感染能夠通過(guò)PD-1/PD-1L途徑來(lái)負(fù)向協(xié)同刺激免疫應(yīng)答,抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的殺傷作用〔18〕。劉婷婷等〔19〕研究認(rèn)為,PD-1在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細(xì)胞中的表達(dá)明顯增多且與CD4+T細(xì)胞數(shù)目、HIV病毒載量有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),中老年HIV組PD-1水平與對(duì)照組相比均上升,并且PD-1為影響中老年HIV感染發(fā)生因素,且PD-1與CD4+/CD8+比值之間具有相關(guān)性,與以上研究結(jié)果一致。

ADAM17屬于一種金屬蛋白酶域的蛋白,其活性的ADAM17主要功能可剪切許多跨膜細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的細(xì)胞外功能,形成游離的活性形式并激活效應(yīng)的受體,并在下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮生物學(xué)作用〔20〕。崔博翔等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),ADAM17在腫瘤中多數(shù)為高表達(dá),主要因α轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子形成一條分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中參與重要作用。另外有報(bào)道顯示,ADAM17在乳腺癌組織中的表達(dá)量與淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移的數(shù)目呈正相關(guān),因此證實(shí)ADAM17與乳腺癌的進(jìn)展有著密切關(guān)系〔22〕。本研究結(jié)果顯示,中老年HIV感染中ADAM17表達(dá)量降低,可表明ADAM17活性異常表達(dá)增加HIV感染的惡性趨勢(shì),但有關(guān)ADAM17參與HIV感染的機(jī)制尚未明確還需進(jìn)一步深入研究。