黃其志 王蕾 錢冉 盧葵花 黎榮

(1湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北 咸寧 437100;2咸寧市職業(yè)教育(集團(tuán))學(xué)校臨床護(hù)理教研室)

我國(guó)人口老齡化問題日益突出,據(jù)估計(jì),2021年以后的10余年,中國(guó)60歲以上人群數(shù)量將達(dá)到(3～4)億〔1〕。眾所周知,多數(shù)癌癥的發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增高,故癌癥已成為當(dāng)前對(duì)人類健康構(gòu)成危險(xiǎn)的最重要危險(xiǎn)因素。結(jié)直腸癌(CRC)作為最常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢(shì)〔2〕。盡管在CRC診斷上獲得一些進(jìn)步,但大多患者確診時(shí)已為中晚期,喪失最佳治療時(shí)機(jī)。目前臨床常采用直腸指診、腸鏡及磁共振成像(MRI)等影像技術(shù)作為診斷方法,但由于檢查常伴隨不適感受,加之費(fèi)用昂貴,使得患者依從性差,從而延遲診治?！耙后w活檢”作為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)性檢查手段,易被患者所接受,但目前常用的CRC血清腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原(CEA),糖類抗原(CA)199等敏感度和特異度均不高,難以滿足CRC的臨床診斷〔3〕。故應(yīng)繼續(xù)探尋高敏感度、特異度的新型血清標(biāo)志物,提高CRC的診斷水平。

外泌體是具有磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡,在血液、尿液等多種體液中廣泛存在〔4〕。外泌體中攜帶著各種細(xì)胞來源的生物活性因子,包括微小RNA(miRNA)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等。研究證實(shí),外泌體及其內(nèi)容物能夠反映細(xì)胞的生理病理改變,故可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物〔5〕。miR-148a是被廣泛關(guān)注的微小非編碼RNA,在多種腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且其血清表達(dá)對(duì)惡性腫瘤有輔助診斷意義〔6-7〕,但目前關(guān)于miR-148a在CRC血清外泌體中表達(dá)水平及臨床意義的報(bào)道尚為缺乏。本研究檢測(cè)CRC患者血清miR-148a表達(dá)水平,并評(píng)估其對(duì)CRC的診斷效能。

1 材料與方法

1.1病例資料 選取2019年1月至2022年6月在湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院確診的CRC老年患者80例(CRC組),其中男49例,女31例;年齡60～85歲,平均(68.38±6.32)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)組織病理學(xué)診斷為CRC;(2)取材前未接受抗腫瘤治療;(3)年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位腫瘤;(2)合并嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病;(3)既往有結(jié)直腸手術(shù)史;(4)合并重要臟器功能障礙;(5)未接受手術(shù)治療。另選取醫(yī)院同期老年健康體檢者50例(對(duì)照組),其中男27例,女23例;年齡60～81歲,平均(67.45±5.71)歲,均排除全身性疾病(糖尿病、高血壓等)、任何惡性病變及既往惡性腫瘤病史。本研究未違反倫理相關(guān)規(guī)定且獲得批準(zhǔn),入組者均簽署知情同意書。根據(jù)miR-148a表達(dá)量,以其中位值(0.49)作為分界,將80例CRC患者分高表達(dá)組與低表達(dá)組各40例。

1.2血清標(biāo)本采集 受試者均抽取空腹靜脈血5 ml,置于促凝管中保存,室溫條件下靜置約30 min,然后離心(3 000 r/min)15 min,留取血清,將血清標(biāo)本置于-80 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血清外泌體提取 應(yīng)用ExoQuick試劑盒進(jìn)行血清外泌體提取,遵照試劑盒說明書進(jìn)行操作。吸取解凍后的血清標(biāo)本400 μl,加入ExoQuick試劑100 μl,予以充分混勻。于4 ℃條件下靜置30 min,然后離心(3 000 r/min)30 min,棄掉上清。再離心(1 500 r/min)5 min,得到的沉淀物即外泌體。

1.4外泌體RNA的提取及miR-148a的相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 應(yīng)用microRNAcute提取分離試劑盒進(jìn)行外泌體RNA的提取,嚴(yán)格遵照試劑盒說明書操作。應(yīng)用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒來完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄,整個(gè)過程于冰上進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μl,包括外泌體RNA 500 ng,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶Mix 0.5 μl,反應(yīng)緩沖液 Mix Ⅱ 2 μl,以雙蒸水補(bǔ)充至10 μl。反應(yīng)程序:42 ℃,15 min;85 ℃,15 min,將獲得的cDNA產(chǎn)物迅速于冰上進(jìn)行冷卻。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法,檢測(cè)miRNA-148a表達(dá)量。PCR程序:95 ℃ 10 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參,以2-ΔΔCt表示miRNA-384的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn);應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)miR-148a等對(duì)CRC的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1血清外泌體miR-148a表達(dá)水平 CRC組血清外泌體miR-148a表達(dá)水平(0.53±0.13)顯著低于對(duì)照組(1.02±0.27,t=15.813、P<0.001)。

2.2老年CRC患者血清外泌體miR-148a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 miR-148a低表達(dá)組腫瘤直徑>2 cm比例、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級(jí)(TNM)為Ⅲ+Ⅳ比例和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2+N3比例均顯著高于miR-148a高表達(dá)組(P<0.05);不同miR-148a表達(dá)組性別、年齡、腫瘤部位等比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CRC患者血清外泌體miR-148a表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%),n=40〕

2.3血清外泌體miR-148a對(duì)CRC的診斷效能評(píng)估 與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA和CA199診斷CRC的曲線下面積(AUC)(0.797、0.766;95%CI:0.717～0.862、0.684～0.836)相比,血清外泌體miR-148a(0.911;95%CI:0.849～0.954)更優(yōu)。當(dāng)血清外泌體miR-148a的截?cái)帱c(diǎn)為0.75時(shí),診斷效能最大,其敏感度為88.7%,特異度為82.0%。見圖1。外泌體miR-148a還能夠有效區(qū)分早期(Ⅰ+Ⅱ)CRC與健康體檢者,與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA和CA199 AUC(0.749、0.757;95%CI:0.649～0.833、0.680～0.857)比較,外泌體miR-148a(0.895;95%CI:0.815～0.949)更優(yōu),當(dāng)血清外泌體miR-148a的截?cái)帱c(diǎn)為0.79時(shí),診斷效能最大,其敏感度為86.4%,特異度為82.0%。見圖2。

圖1 血清外泌體miR-148a及CEA、CA199診斷CRC的ROC曲線

圖2 血清外泌體miR-148a及CEA、CA199區(qū)分早期CRC與健康體檢者的ROC曲線

3 討 論

CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)出老年化趨勢(shì),高齡已成為CRC發(fā)病的重災(zāi)區(qū)〔8,9〕。由于早期癥狀隱匿,加之老年患者常合并基礎(chǔ)疾病,癥狀更容易被忽視,故CRC的早期診斷一直是臨床難點(diǎn)〔10〕?！耙后w活檢”用于腫瘤早期診斷,具有簡(jiǎn)便、非侵入性的優(yōu)點(diǎn)。本研究提示,血清外泌體miR-148a可作為CRC診斷的潛在標(biāo)志物。

有研究表明〔11〕,miRNAs可在外泌體中穩(wěn)定存在并能夠反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,同時(shí)其成分沒有血清復(fù)雜,使得外泌體miRNAs成為可靠、無創(chuàng)的生物標(biāo)志物,對(duì)于多種腫瘤的診斷有重要意義。在各種miRNA中,miR-148a受到廣泛關(guān)注,參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但其在腫瘤中的作用尚無定論。在前列腺癌中,miR-148a可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲〔12〕,且關(guān)于膠質(zhì)母瘤細(xì)胞的研究〔13〕中發(fā)現(xiàn),miR-148a可能是一種癌基因。Hibino等〔14〕報(bào)道,miR-148a表達(dá)下調(diào)促進(jìn)CRC的進(jìn)展,尤其是癌細(xì)胞的侵襲。蔣學(xué)軍等〔15〕發(fā)現(xiàn),miR-148a能夠直接靶向Wnt1/β-catenin通路,抑制CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Takahashi等〔16〕研究表明,miR-148a在CRC患者中呈低表達(dá),且與患者不良預(yù)后有關(guān)。以上研究提示,miR-148a參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且在CRC中可能屬于抑癌基因。

本研究證實(shí)外泌體miR-148a低表達(dá)與CRC腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素相關(guān),其低表達(dá)可作為CRC診斷的依據(jù),尤其對(duì)于早期CRC的診斷有重要意義。目前,臨床中CRC早期診斷主要方法主要為CT、MRI,這其中存在假陽性率高、費(fèi)用昂貴及多次檢查的放射危害〔17〕。研究表明〔18〕,血清外泌體內(nèi)含物核酸、蛋白質(zhì)等能夠反映細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài),對(duì)于腫瘤的篩選有重要作用,有望作為傳統(tǒng)影像學(xué)的替代。臨床工作中用于CRC診斷的腫瘤標(biāo)志物主要為CEA、CA199,均具有一定的敏感度和特異度〔19,20〕。本研究表明,血清外泌體miR-148a對(duì)CRC的診斷效能更優(yōu),可能是較常規(guī)腫瘤標(biāo)志物更好的CRC診斷指標(biāo)。本研究不足之處:首先,僅是初步驗(yàn)證miR-148a在CRC中的診斷意義,且樣本量有限,未來仍需進(jìn)行更大樣本量的研究驗(yàn)證miR-148a的診斷價(jià)值;其次,納入對(duì)象欠缺,設(shè)計(jì)之初未納入結(jié)直腸良性病變?nèi)缃Y(jié)直腸息肉等作為對(duì)照,在后續(xù)研究中,應(yīng)收集結(jié)直腸各種良性病變,以評(píng)價(jià)miR-148a對(duì)CRC診斷的特異性;最后,還需進(jìn)一步探討外泌體miR-148a在CRC中的生物學(xué)作用、機(jī)制,以明確其在CRC診斷中的臨床價(jià)值。