胡國(guó)梅 張瑜 程曉菊

(遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院),貴州 遵義 563000)

由于老年人機(jī)體功能開(kāi)始衰弱,大腸黏膜和肌層萎縮,吸收水分及蠕動(dòng)能力減退,加之飲食習(xí)慣和其他因素影響,其腸黏膜細(xì)胞突變風(fēng)險(xiǎn)高于青年人群,更易病發(fā)結(jié)直腸癌,危害性更大〔1〕。手術(shù)是目前根治老年結(jié)直腸癌的重要手段,但對(duì)于腫瘤侵襲程度深、中晚期的患者預(yù)后較差,臨床須結(jié)合患者的臨床病理特征開(kāi)展手術(shù)聯(lián)合化療、放療、生物靶向治療等針對(duì)性治療〔2〕。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中多種生物學(xué)指標(biāo)與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡存在緊密關(guān)系〔3〕。E-鈣黏蛋白(E-cad)存在于上皮細(xì)胞膜上,在細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化過(guò)程中扮演角色,其水平下調(diào)會(huì)促使癌細(xì)胞入侵周?chē)M織,加快腫瘤惡性進(jìn)展〔4〕。解整合素-金屬蛋白酶(ADAM)17屬于ADAM家族成員之一,又稱(chēng)為腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶,參與多種病理過(guò)程尤其是在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移層面〔5〕。本研究對(duì)老年結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織中E-cad和ADAM17表達(dá)情況進(jìn)行研究,分析上述兩種蛋白在影響老年結(jié)直腸癌腫瘤分期及侵襲深度中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 本研究為前瞻性研究,經(jīng)遵義市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),納入2019年12月至2021年12月收治的100例老年結(jié)直腸癌患者,男61例、女39例;年齡61～86,平均(73.52±4.16)歲。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①結(jié)直腸癌符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015年版)》〔6〕中的診斷標(biāo)準(zhǔn),且最終經(jīng)術(shù)后病理確診;②首次發(fā)病,年齡介于60～90歲;③入院前未接受放化療或其他輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤;②合并免疫缺陷或全身免疫性疾病;③合并內(nèi)分泌疾病或全身傳染性疾病;④合并出血性疾病、血液病;⑤長(zhǎng)期服用免疫增強(qiáng)或抑制劑。

1.3癌組織及癌旁正常組織中E-cad、ADAM17的檢測(cè)及結(jié)果判定 ①檢測(cè)方法:按照標(biāo)準(zhǔn)化操作取材,檢測(cè)過(guò)程按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集每例患者癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織各1份,使用常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片獲得組織切片(切片厚度為5 μm)。接著依次行組織切片恒溫箱中烘烤、二甲苯、梯度酒精清洗,常規(guī)水洗后用高壓熱修復(fù)預(yù)處理技術(shù)對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)。滴加內(nèi)源性過(guò)氧化氫阻斷劑,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗并滴加E-cad、ADAM17一抗,常規(guī)孵育過(guò)夜。再用PBS清洗3次,2 min/次,加入通用型二抗。在室溫下孵育20 min后用PBS清洗3次,2 min/次,用二氨基聯(lián)苯胺法進(jìn)行顯色。最后常規(guī)復(fù)染并用中性樹(shù)膠封固。②結(jié)果判定:由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立采用高倍視野(×200)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行診斷,隨機(jī)取鏡下5個(gè)視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照,用已確定的陽(yáng)性樣本作為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算染色細(xì)胞的百分率并統(tǒng)計(jì)染色強(qiáng)度。對(duì)染色細(xì)胞的百分率與染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分,若染色細(xì)胞著色細(xì)胞數(shù)>50%計(jì)3分,>10%且≤50%計(jì)2分,≤10%計(jì)1分,無(wú)著色計(jì)0分;若染色強(qiáng)度為棕褐色計(jì)3分,棕黃色計(jì)2分,淡黃色計(jì)1分,無(wú)著色計(jì)0分。結(jié)果判定:兩項(xiàng)得分乘積<2分為陰性,得分乘積≥2分為陽(yáng)性。

1.4基線(xiàn)資料收集 設(shè)計(jì)患者基線(xiàn)資料填寫(xiě)表并統(tǒng)計(jì)記錄患者的臨床特征,包括年齡、性別(男、女)、病理類(lèi)型(腺癌、鱗癌)、結(jié)直腸癌TNM分期〔7〕(Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期)。Ⅰ期:腫瘤局限于黏膜層,或腫瘤雖已經(jīng)侵入固有肌層,但無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;Ⅱ期:腫瘤已經(jīng)侵入固有肌層,可侵犯漿膜層并伴較少的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但沒(méi)有侵犯鄰近的組織結(jié)構(gòu)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;Ⅲ期:腫瘤侵及黏膜固有層或肌層,直到侵及漿膜層,伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;Ⅳ期:腫瘤有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移,伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,腫瘤可侵入黏膜層或肌層,直到侵及漿膜層)、癌組織侵襲程度(浸潤(rùn)>1/2肌層,浸潤(rùn)≤1/2肌層)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有、無(wú))。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及多因素Logistic回歸分析檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組E-cad、ADAM17在不同組織中表達(dá) 老年結(jié)直腸癌組織中E-cad陽(yáng)性表達(dá)率〔41.00%(41/100)〕顯著低于癌旁正常組織〔73.00%(73/100);χ2=20.889,P<0.001〕,ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率〔78.00%(78/100)〕顯著高于癌旁正常組織〔17.00%(17/100);χ2=74.607,P<0.001〕。

2.2不同臨床特征老年結(jié)直腸癌E-cad、ADAM17表達(dá) TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織E-cad陽(yáng)性表達(dá)率低于Ⅰ～Ⅱ期,ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期;癌組織侵襲程度>1/2肌層患者癌組織中E-cad陽(yáng)性表達(dá)率低于癌組織侵襲程度≤1/2肌層者,ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率高于腫瘤侵襲深度≤1/2肌層者,上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征老年結(jié)直腸癌患者E-cad、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)比較〔n(%)〕

2.3E-cad、ADAM17表達(dá)與腫瘤分期、侵襲深度的關(guān)系 分別將老年結(jié)直腸癌患者侵襲深度(1=浸潤(rùn)>1/2肌層,0=浸潤(rùn)≤1/2肌層)、腫瘤TNM分期(1=Ⅲ～Ⅳ期,0=Ⅰ～Ⅱ期)作為因變量,將癌組織中E-cad表達(dá)作為自變量(1=陰性,0=陽(yáng)性),ADAM17表達(dá)作為自變量(1=陽(yáng)性,0=陰性)。經(jīng)多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),E-cad陰性表達(dá)、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)與老年結(jié)直腸癌患者腫瘤侵襲程度深、TNM分期高有關(guān)(OR>1,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 癌組織E-cad、ADAM17表達(dá)與腫瘤侵襲深度、TNM分期關(guān)系的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

老年結(jié)直腸癌患者早期癥狀缺乏特異性,易與胃腸道及腹腔其他疾病混淆,在明顯癥狀至醫(yī)院檢查時(shí)已處于癌癥中晚期,腫瘤侵襲程度深,在接受手術(shù)及相關(guān)治療后預(yù)后不佳,風(fēng)險(xiǎn)高,生存期短〔8〕。研究證實(shí),腫瘤細(xì)胞的增殖及其凋亡失控是推動(dòng)腫瘤發(fā)展的重要原因,無(wú)限增殖的腫瘤細(xì)胞易堆積成實(shí)體腫瘤并浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,凋亡失控的癌細(xì)胞難以程序性變性和死亡〔9〕。明確腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的生物標(biāo)志物對(duì)腫瘤分期及侵襲深度的診斷評(píng)估及針對(duì)性治療的開(kāi)展具有重要意義。

E-cad正常表達(dá)可維持上皮細(xì)胞機(jī)體表面的屏障作用,水平下調(diào)會(huì)降低組織內(nèi)細(xì)胞黏附的強(qiáng)度,使上皮細(xì)胞獲得流動(dòng)性大的間充質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)而允許癌細(xì)胞入侵周?chē)＝M織〔10〕。ADAM17是一種功能多樣的多結(jié)構(gòu)域跨膜糖蛋白,參與多種促腫瘤的形成與進(jìn)展相關(guān)配體的釋放,對(duì)腫瘤惡性進(jìn)展影響巨大〔11〕。本研究說(shuō)明,E-cad、ADAM17表達(dá)與老年結(jié)直腸癌腫瘤惡性進(jìn)展關(guān)系密切。由此,進(jìn)一步考慮老年結(jié)直腸癌組織中E-cad、ADAM17表達(dá)或與腫瘤侵襲程度深、TNM分期高有關(guān)。

本研究經(jīng)多因素Logistic回歸分析,證實(shí)E-cad陰性表達(dá)、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)與老年結(jié)直腸癌患者腫瘤侵襲程度深、TNM分期高有關(guān)。分析其原因在于,E-cad直接介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附,E-cad陽(yáng)性表達(dá)時(shí)表明患者上皮細(xì)胞之間的黏附性較強(qiáng),有利于細(xì)胞形成有固定結(jié)構(gòu)和形態(tài)的組織,可有效阻礙癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移;而當(dāng)E-cad缺失呈陰性表達(dá)時(shí),會(huì)誘發(fā)患者上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,使上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性(高度流動(dòng)性),此時(shí)患者容易發(fā)生細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶增加、上皮細(xì)胞變性等一系列惡性變化,大大便利了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,最終導(dǎo)致老年結(jié)直腸腫瘤侵襲程度深、腫瘤進(jìn)展至中晚期〔12,13〕。ADAM17具有解聚素和金屬蛋白酶的活性,能通過(guò)蛋白水解作用裂解錨定于細(xì)胞膜上的多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附因子、蛋白酶、受體和配體,繼而產(chǎn)生一系列生物學(xué)事件,其陽(yáng)性表達(dá)可激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的表皮生長(zhǎng)因子,而活化的表皮生長(zhǎng)因子可以激活多條下游細(xì)胞通路,如絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶及多條離子通路,從而為腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲提供有利條件;同時(shí)細(xì)胞褶皺和黏著斑處ADAM17可作為細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的連接點(diǎn)與整合素α5產(chǎn)生相互作用,還可降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì),造成癌細(xì)胞表面黏附分子水平降低,繼而難以有效抑制癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,加快腫瘤惡性進(jìn)展〔14,15〕。

綜上,老年結(jié)直腸癌患者癌組織中E-cad陽(yáng)性表達(dá)率低,ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率高,且癌組織中E-cad陰性表達(dá)、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)與患者腫瘤侵襲程度深、TNM分期高有關(guān)。