馬大偉 鮑鴻斌 王亞琳 李寧 徐浩奕

(1衡水市人民醫(yī)院肝膽胰外科,河北 衡水 053000;2衡水市第四人民醫(yī)院急診科)

膽總管結(jié)石引發(fā)的膽管細(xì)胞癌是膽管上皮細(xì)胞增生發(fā)展為不典型增生及腺癌樣癌變的過程〔1〕。膽管細(xì)胞癌包括起源于膽管上皮的所有腫瘤,多數(shù)膽管細(xì)胞癌為腺癌,可分為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和肝外膽管細(xì)胞癌兩大類〔2〕。研究顯示,肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌是肝膽內(nèi)管被覆上皮形成的原發(fā)性癌,病理機制及原因尚不明確,但與膽管疾病具有相關(guān)性〔3〕。由于肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的特殊位置及較高的惡性程度,導(dǎo)致其死亡率較高,手術(shù)治療效果不理想,因此早期診斷和預(yù)防尤為重要,近年來探索新的診斷和預(yù)后相關(guān)因子已成為診斷和治療膽管細(xì)胞癌的研究重點〔4〕。人表皮生長因子受體(HER)2是一種糖蛋白,研究顯示其在肺癌、乳胃癌等多種癌癥中高表達(dá),有望成為鑒別惡性腫瘤的新型指標(biāo)〔5〕。Claudin-18是細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的骨骼蛋白,眾多的研究已經(jīng)證實其與肺癌、胃癌等癌癥存在密切關(guān)系〔6〕。但HER2和Claudin-18在膽管細(xì)胞癌中的相關(guān)研究尚無報道,推測其可能與膽管細(xì)胞癌存在關(guān)系。本研究探討HER2和Claudin-18在膽總管結(jié)石和膽管細(xì)胞癌患者手術(shù)前后的表達(dá)差異性及其與膽管疾病的相關(guān)性和對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月在衡水市人民醫(yī)院肝膽外科接受腫瘤手術(shù)治療的膽總管結(jié)石合并膽管細(xì)胞癌患者50例為膽管癌組,患者均經(jīng)病理檢查確診,其中男26例,女24例,平均年齡(62.3±10.2)歲。單純膽總管結(jié)石患者50例為膽總管結(jié)石組,男23例,女27例,平均年齡(61.5±11.4)歲。同期體檢健康者50例為健康組,男27例,女23例,平均年齡(62.8±10.5)歲。按照2019年版世界衛(wèi)生組織(WHO)膽管細(xì)胞癌組織學(xué)分級,高分化15例,中分化13例,低分化22例;Ⅰ～Ⅱ級19級,Ⅲ～Ⅳ級31級。研究對象均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床診斷符合膽總管結(jié)石合并膽管細(xì)胞癌〔7〕,并經(jīng)病理診斷確診;(2)術(shù)前未進行化療、放療治療;(3)預(yù)期生存時間≥3個月;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有各臟腑器官及腦血管、血液等嚴(yán)重疾病者;(2)患有其他腫瘤者。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2檢測外周血HER2 和Claudin-18 采集兩組患者術(shù)前和術(shù)后空腹1 w血液3～5 ml,離心后獲取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測HER2 和Claudin-18蛋白表達(dá)。

1.3免疫組化法檢測組織中HER2 和Claudin-18表達(dá) 獲取術(shù)中膽總管結(jié)石合并膽管細(xì)胞癌患者癌組織及癌旁組織樣本、膽總管結(jié)石患者的膽管組織。樣本處理:HER2多克隆抗體(美國Dako公司),SP法免疫組化試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。石蠟切片脫水,加3%H2O2室溫靜置10 min去除內(nèi)源性過氧化酶,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂后檸檬酸熱抗原修復(fù),PBS漂洗3×5 min;加入山羊血清,2 h后,漂洗2次,加一抗(1 μg/ml),4 ℃孵育過夜,再漂洗3×5 min,加二抗,經(jīng)室溫孵育,漂洗后,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液,顯微鏡下觀察,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。采用Formwitz半定量積分法,光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機選取5個100倍視野,計數(shù)陽性細(xì)胞并觀察染色強度。0分:陽性細(xì)胞比率≤5%,染色強度無色。1分:陽性細(xì)胞比率6%～25%,染色強度淡黃色。2分:陽性細(xì)胞比率26%～50%,染色強度黃色。3分:陽性細(xì)胞比率51%～75%,染色強度棕黃色。4分:陽性細(xì)胞比率>75%?？偡譃殛栃约?xì)胞比率與染色強度評分之積:陰性0分,標(biāo)記為(-);弱陽性1～4分,標(biāo)記為(+);中等陽性5～8分,標(biāo)記為(),強陽性9～12分,標(biāo)記為();低表達(dá)0～8分,高表達(dá)9～12分。

1.4Western印跡檢測HER2 和Claudin-18蛋白表達(dá) 提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白量,電泳轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入羊抗人Claudin-18、HER2(1∶500)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),稀釋1∶1 000的β-actin單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG(北京博爾西科技有限公司),二抗室溫孵育2 h,PBST洗滌后顯色、曝光、顯影、定影。實驗重復(fù)2次。

1.5術(shù)后隨訪 術(shù)后每3個月對患者隨訪1次,隨訪最長時間為3年,記錄患者生存時間,有無轉(zhuǎn)移等,統(tǒng)計存活率并進行生存分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中HER2和Claudin-18水平(P>0.05) 術(shù)前及術(shù)后觀察組血清HER2和Claudin-18水平顯著高于術(shù)前及術(shù)后對照組和健康組(P<0.05);健康組與對照組術(shù)前、術(shù)后及組間比較水平無顯著差異(P>0.05)。術(shù)后觀察組血清HER2和Claudin-18水平顯著低于術(shù)前(P<0.05),見表1。

表1 各組手術(shù)前后血清HER2和Claudin-18水平比較(n=50,μg/L)

2.2兩組組織中HER2和Claudin-18陽性率比較 癌組織中HER2和Claudin-18陽性率(94.0%、92.0%)顯著高于膽管組織(8.0%、6.0%)及癌旁組織(10.0%、8.0%;均P<0.05),癌旁組織與膽管組織間陽性率比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組織中HER2和Claudin-18表達(dá)(免疫組化,×200)

2.3膽管細(xì)胞癌患者HER2、Claudin-18與臨床病理的相關(guān)性 HER2、Claudin-18表達(dá)水平與性別、年齡無顯著相關(guān)性(P>0.05),與組織學(xué)分級、血管浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)(r=0.621、0.322、0.628,均P<0.05),與細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.372,P<0.05)。HER2與Claudin-18具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.723,P<0.05)。經(jīng)檢測膽管細(xì)胞癌患者HER2高表達(dá)34例,低表達(dá)16例,Claudin-18高表達(dá)37例,低表達(dá)13例。HER2、Claudin-18表達(dá)水平在性別、年齡方面無顯著差異(P>0.05),在組織學(xué)分級、分化程度、血管浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異明顯(P<0.05)。見表2。

表2 膽管細(xì)胞癌患者HER2、Claudin-18高表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性(n)

2.4Western印跡檢測不同分化程度膽管細(xì)胞癌組織中HER2、Claudin-18蛋白表達(dá) 不同分化程度的膽管細(xì)胞癌組織HER2、Claudin-18表達(dá)顯示,低分化表達(dá)顯著高于中分化,中分化顯著高于高分化(P<0.05)。見表3。

表3 不同分化程度膽管細(xì)胞癌組織中HER2、Claudin-18蛋白表達(dá)

2.5膽管細(xì)胞癌患者HER2、Claudin-18與預(yù)后關(guān)系 術(shù)后隨訪3年,HER2高表達(dá)34例,死亡13例,低表達(dá)16例,死亡1例。Claudin-18高表達(dá)37例,死亡13例,低表達(dá)13例,死亡1例。與低表達(dá)患者相比,高表達(dá)HER2、Claudin-18患者生存時間顯著較短(P<0.05)。見圖2。

圖2 膽管細(xì)胞癌組織中HER2、Claudin-18表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

2.6影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者預(yù)后的危險因素 針對膽管細(xì)胞癌患者相關(guān)臨床指標(biāo):HER2、Claudin-18、膽總管結(jié)石、膽囊結(jié)石、肝硬化、脂肪性肝炎進行Logistic回歸分析顯示,HER2、Claudin-18、肝硬化、膽總管結(jié)石是肝內(nèi)膽管癌發(fā)病的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 膽管細(xì)胞癌患者發(fā)病的危險因素Logistic回歸分析

2.7靈敏度、特異性曲線 HER2、Claudin-18的受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示,HER2、Claudin-18曲線下面積分別為0.874(0.794～0.954)、0.977(0.970～0.984),具有很高的檢測靈敏度(P<0.05)。見圖3。

圖3 HER2、Claudin-18檢測對膽管細(xì)胞癌診斷的ROC曲線

3 討 論

膽總管結(jié)石易致膽汁滯留且常伴有不同程度的膽管機械性損傷或感染進而引起慢性炎性增生不典型增生甚至發(fā)展為膽管細(xì)胞癌變。膽總管結(jié)石合并膽管細(xì)胞癌預(yù)后極差,患者在發(fā)現(xiàn)時往往已屬晚期〔8〕。手術(shù)治療是膽總管結(jié)石合并膽管細(xì)胞癌的有效方式,手術(shù)可將癌組織結(jié)石同時去除,減少復(fù)發(fā)可能性,延長術(shù)后生存時間。研究顯示,早發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌對于治療方案的制定和時機把握及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)有重要意義〔9〕。HER2、Claudin-18在很多腫瘤組織中表達(dá)水平升高,并與預(yù)后存在相關(guān)性,本研究結(jié)果表明,HER2、Claudin-18在膽管細(xì)胞癌的病情中存在表達(dá)差異,可能與病情發(fā)作存在關(guān)系。

HER2在細(xì)胞分裂增殖及信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用,其擴增和過度表達(dá)與人類癌癥和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔10〕。HER2的擴增是腫瘤侵襲性的一個因素,其與更頻繁的復(fù)發(fā)和較差的生存率相關(guān)〔11〕。也有研究發(fā)現(xiàn),在超過1/4的轉(zhuǎn)移性乳腺癌中HER2受體過度表達(dá)〔12〕,另外也有很多研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌、胃癌等多種癌癥中HER2表達(dá)增強。本研究結(jié)果提示,HRE2可能參與了膽管細(xì)胞癌的病情發(fā)展。Claudin蛋白是一類參與構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的細(xì)胞表面分子,共包含了27種亞型,Claudin-18是其中之一,其功能主要為維持細(xì)胞間黏附調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性維持細(xì)胞極性〔13〕。研究顯示,Claudin-18蛋白在局部差異性表達(dá)將會造成細(xì)胞屏障功能的改變,在腫瘤發(fā)生和遷移過程中發(fā)生作用〔14〕。研究顯示,在胃癌組織中Claudin-18蛋白表達(dá)降低并與轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)〔15〕,在膽管組織中Claudin-18表達(dá)高于健康組織〔16〕。本研究結(jié)果提示,Claudin-18可能參與了膽管細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。由以往研究及本研究結(jié)果可見,HETR2、Claudin-18可能參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程,并在多種癌細(xì)胞的細(xì)胞膜表面表達(dá),這使其成為靶向治療靶點研究的重要指標(biāo)。

當(dāng)前誘發(fā)膽管細(xì)胞癌公認(rèn)的危險因素有膽管結(jié)石、寄生蟲感染、膽管炎等,而針對膽管細(xì)胞癌的預(yù)后的危險因素研究顯示,有淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,其預(yù)后明顯差于無轉(zhuǎn)移的患者〔17〕,腫瘤的分化程度也與預(yù)后明顯相關(guān)〔18〕。研究發(fā)現(xiàn),HER2在大約15%的浸潤性乳腺癌中過度表達(dá)和擴增,是抗HER2藥物反應(yīng)的分子靶點和預(yù)測標(biāo)記〔19〕。Claudin-18在胰腺癌中陽性表達(dá)率>96%,且隨分化程度升高表達(dá)顯著升高,在上皮病變中可達(dá)98%〔20〕。本研究結(jié)果提示,HER2、Claudin-18與膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系、也有其他研究報道HER2的過表達(dá)與病理分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)〔21,22〕,有關(guān)Claudin-18蛋白的研究顯示,其可參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,并在增殖和分化凋亡過程中發(fā)揮了重要作用〔23〕,這與本研究結(jié)果相似。但有報道發(fā)現(xiàn),Claudin-18在肺腺癌中的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)〔24〕,這與本研究結(jié)論存在一定差異,可能原因為Claudin-18在不同癌癥中的異質(zhì)性差異所致,需要進一步研究。

研究表明,HER2與多種腫瘤的預(yù)后不良因素有關(guān),其是胃癌、乳腺癌、腸癌等惡性腫瘤的獨立危險因素〔25,26〕,而Claudin-18在進展期胃印戒細(xì)胞癌(SRCC)患者中高表達(dá),其在原發(fā)性胃癌和進展期胃SRCC中的表達(dá)差異有顯著性(77% vs 95.24%),提示以Claudin-18為基礎(chǔ)的靶向治療在進展期胃SRCC的治療中具有很大的潛力〔27〕。本研究結(jié)果提示,HER2、Claudin-18表達(dá)可影響患者預(yù)后生存時間,二者可能在膽管細(xì)胞癌患者的預(yù)后中發(fā)揮作用。這為膽管細(xì)胞癌的預(yù)防提供重要參考價值,另外通過靈敏度曲線分析顯示,檢測HER2、Claudin-18具有很高的敏感度,對膽管細(xì)胞癌早期檢測有指導(dǎo)意義。

綜上,HER2和Claudin-18與肝外膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),其可能成為其臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。