任 浩，鄭立輝,2,3**，杜博奧

（1. 東北石油大學(xué)秦皇島校區(qū) 河北 秦皇島 066004；2.秦皇島市海洋油氣資源開發(fā)與污染防治重點實驗室 河北 秦皇島 066004；3. 東北石油大學(xué)應(yīng)用技術(shù)研究院 黑龍江 大慶 163318）

0 引言

熒光檢測技術(shù)以無污染、響應(yīng)快、靈敏度高和易于操作等特點而被廣泛應(yīng)用于離子檢測、分子識別、細胞標(biāo)記、光動力治療等領(lǐng)域[1-6]。尤其在生命科學(xué)進入縱深發(fā)展的時代背景下，對生命過程中超痕量物質(zhì)進行分析和檢測時，熒光技術(shù)更凸顯了其不可比擬的優(yōu)勢。現(xiàn)已開發(fā)的熒光探針主要包括卟啉類、香豆素類、羅丹明類、硼二吡咯亞甲基二氟（BODIPY）類、菁染料等。其中，菁染料通過多甲川共軛鏈連接電子給體D（Donor）和受體A（Acceptor），其吸收和發(fā)射光譜受甲川鏈長度及取代基的影響，可實現(xiàn)在可見光區(qū)和近紅外光區(qū)的全覆蓋，從而在生物分析中得到了廣泛應(yīng)用[7]。尤其七甲川菁染料，其最大吸收和發(fā)射波長在800 nm 附近的生物空白窗口區(qū)，在生物分析過程中，能有效避開生物背景熒光的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。在2000年，美國FDA 批準(zhǔn)七甲川菁染料ICG（圖1）用于臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用，推動了針對七甲川菁染料的進一步研究。然而，由于ICG 等七甲川菁染料是通過線性甲川鏈連接電子給體D（Donor）和受體A（Acceptor），其光穩(wěn)定性較差；同時該染料還存在Stokes 位移小、熒光量子產(chǎn)率不高、易于熒光淬滅等問題，這些都成為當(dāng)前七甲川菁染料進一步應(yīng)用急需解決的現(xiàn)實問題。因此，通過結(jié)構(gòu)調(diào)控優(yōu)化分子性能，不僅可以彌補當(dāng)前七甲川菁染料在實際應(yīng)用中的缺陷，而且對開發(fā)功能更為多樣的菁染料具有重要的指導(dǎo)意義。

圖1 ICG 的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of ICG

1 七甲川菁染料的結(jié)構(gòu)

七甲川菁染料是由含活性亞甲基的堿性氮雜環(huán)（吲哚、噻唑、噁唑等）與醛類化合物縮合而成。通過含七個碳原子的多甲川鏈連接兩個堿性氮雜環(huán)，形成具有一定電子“推-拉”作用的共軛體系，由于整個分子具有較大的共軛體系，共平面性較好，因此具有較好的熒光性能。當(dāng)分子端位堿性氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)相同時，分子具有較好的對稱性，稱為對稱七甲川菁染料，堿性氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)不同時，分子失去對稱性，稱為不對稱七甲川菁染料。分子中氮雜環(huán)的類型、雜環(huán)氮上取代基、苯環(huán)上取代基、共軛鏈類型及共軛鏈上取代基等對多甲川鏈的電子“推-拉”程度以及電子云密度具有較大影響，對染料的穩(wěn)定性和光譜性質(zhì)起著決定性作用。

2 七甲川菁染料端位結(jié)構(gòu)修飾及應(yīng)用

2.1 端位雜環(huán)類型對染料性能影響

七甲川菁染料的吸收光譜隨端位氮雜環(huán)堿性的增加發(fā)生紅移，如姚祖光等[8]開發(fā)了端位雜環(huán)分別為噁唑、吲哚、噻唑和硒唑的七甲川菁染料（如圖2），其在乙醇溶液中的最大吸收波長（λab）分別為734.4 nm、789.8 nm、803.6 nm 和809.4 nm（R=H）。同時，當(dāng)X 為O、S、Se 時，由于沒有取代基，相比吲哚類菁染料（X=N(CH3)2），分子在質(zhì)子溶劑中的聚集程度減弱，增加了分子的熒光量子產(chǎn)率。

圖2 端位雜環(huán)類型不同的七甲川菁染料Fig. 2 The heptamethine cyanine with different terminal heterocycles

然而，隨著分子端位雜環(huán)中雜原子X 的引入，染料的光穩(wěn)定性變差，而且取代雜原子X 的半徑越大，染料的光穩(wěn)定性越差。姚祖光、劉占會，等[8,9]通過對比，均認(rèn)為當(dāng)七甲川菁的多甲川鏈結(jié)構(gòu)相同時，端位氮雜環(huán)為吲哚（X =C）時光穩(wěn)定性最好，雜環(huán)中引入取代雜原子后，染料的光穩(wěn)定順序為噁唑菁（X =O）＞噻唑菁（X =S）＞硒唑菁（X=Se）。因此，在后續(xù)研究中七甲川吲哚菁染料的報道最為常見，七甲川噁唑菁和噻唑菁也偶有報道，如Kateryna V等[10]將七甲川噻唑菁為用于阿爾茲海默癥等病癥的診斷提供參考，而硒唑類七甲川菁染料卻鮮有報道。

2.2 苯環(huán)和端位雜環(huán)N 位取代對染料性能影響

由于苯環(huán)和端位雜環(huán)N 位取代基未直接與分子的共軛鏈相連，因此該位置的取代基對分子的光譜性能影響不大，主要通過電子效應(yīng)、空間效應(yīng)等對分子的穩(wěn)定性、聚集程度產(chǎn)生影響；同時，通過該位置上取代基的引入還可以拓展分子的應(yīng)用領(lǐng)域。Zhang zongren，等[11]基于吲哚環(huán)N 被質(zhì)子化后對多甲川鏈“推-拉”的影響，開發(fā)了一例吲哚環(huán)N 位無取代基的pH 探針（圖3），該探針在中性和堿性環(huán)境中無熒光，而在pH 為4.00-6.00 的弱酸性環(huán)境中與氫離子作用后顯示出較強的熒光，經(jīng)與cRGD 結(jié)合，該探針可用于乳腺癌等癌癥的早期診斷。

圖3 七甲川吲哚菁pH 響應(yīng)機理Fig. 3 The mechanism of heptamethine cyanine used as a pH sensor

苯環(huán)上取代基一般使染料的吸收光譜發(fā)生紅移，但吸電子基通過降低共軛體系的電子云密度增大染料的光穩(wěn)定性，而給電子基通過增大共軛體系的電子云密度而降低染料的光穩(wěn)定性。如在七甲川菁染料端位苯環(huán)上分別引入-Cl 和-OCH3后（圖2），其在乙醇中的λab分別由803.6 nm 紅移到810 nm 和823 nm，但-Cl 的引入增強了染料的光穩(wěn)定性，而-OCH3卻降低了染料的光穩(wěn)定性[8]。Wang Lu等[12]進一步研究了苯環(huán)上取代基對染料熒光性能的影響，發(fā)現(xiàn)由于重原子效應(yīng)，苯環(huán)上-Cl 的引入可使染料的熒光量子產(chǎn)率從6.5 降至1.2。由于苯環(huán)的吸電子效應(yīng)可有效提升染料的光穩(wěn)定性，因此端位具有二苯并吲哚結(jié)構(gòu)的七甲川菁染料（圖4）也得到了很好的開發(fā)[13-14]。

圖4 苯并七甲川吲哚菁結(jié)構(gòu)Fig.4 The structures of benzo-heptamethine cyanine

3 七甲川菁染料多甲川鏈上結(jié)構(gòu)修飾及應(yīng)用

七甲川菁染料由于多甲川鏈較長，化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)能量損失較大，而且容易受到氧或活性自由基的進攻，因而穩(wěn)定性較差。對七甲川菁染料的多甲川鏈進行直接修飾，通過改變電子云密度、增加分子剛性以及調(diào)整空間位阻等方法，成為提高染料穩(wěn)定性的主要手段，同時這些結(jié)構(gòu)修飾也會對染料的溶解性、光譜性質(zhì)、Stokes 位移、熒光量子產(chǎn)率以及應(yīng)用領(lǐng)域等產(chǎn)生較大影響。

3.1 剛性橋環(huán)取代對染料性能的影響

在七甲川菁染料分子的中位引入剛性橋環(huán)，可以增強分子的共平面性，使分子吸收光譜發(fā)生紅移，同時，增強分子的光穩(wěn)定性，但染料分子的熒光量子產(chǎn)率有所降低，同時橋環(huán)上碳原子數(shù)不同時，分子穩(wěn)定程度也不同。Henary 課題組[15]合成了多甲川鏈中位含碳原子數(shù)不同的剛性橋環(huán)菁染料（圖5）。剛性橋環(huán)為五元環(huán)時，染料吸收波長最大（803 nm），摩爾吸光系數(shù)最大，光穩(wěn)定性也最好；而剛性橋環(huán)為六元環(huán)和七元環(huán)時，染料的最大吸收波長基本一致（λab分別為780 nm 和781 nm）；同時橋環(huán)為七元環(huán)時，染料無熒光，摩爾吸光系數(shù)最低，而且光穩(wěn)定性最差。除剛性橋環(huán)外，在橋環(huán)的對位亞甲基上引入取代基同樣會對染料的性能產(chǎn)生一定的影響。如在該位置引入烷基鏈產(chǎn)生的空間位阻的抗聚集，以及氫鍵的促聚集作用，均會對染料的溶解性能產(chǎn)生較大影響。Otsuka 等人[16]發(fā)現(xiàn)在七甲川菁染料雜環(huán)和橋環(huán)上分別引入烷基鏈圖6（a），可極大的減少染料分子的聚集；而Henary 課題組[15]發(fā)現(xiàn)在六元環(huán)對位亞甲基上引入叔丁基圖6（b），染料在PBS 緩沖溶液中的聚集程度增大，熒光量子產(chǎn)率降低。Sopida Thavornpradit[17]利用二甲胺基替代六元環(huán)上的對位亞甲基圖6（c），相比ICG，使染料的摩爾吸光吸收和熒光量子產(chǎn)率分別提升了1.7 和3 倍，同時還增強了染料分子的光穩(wěn)定性以及在水溶液中的溶解性，降低了其生物毒性。

圖5 剛性橋環(huán)碳原子數(shù)不同的七甲川菁染料Fig. 5 The heptamethine cyanine with different carbon atom numbers in the rigid ring

3.2 多甲川鏈中位取代對染料性能影響

在七甲川菁染料分子中位引入剛性橋環(huán)的同時，又引入了新的官能團，這為其進一步結(jié)構(gòu)修飾提供了可能。如在引入六元剛性橋環(huán)時，在分子中位引入了氯或溴，它易于被親核性試劑如胺、硫醇、苯酚、磷化物以及羰基等取代，形成相應(yīng)的衍生物[18,19]（圖7）；還可通過鈀催化Suzuki 偶聯(lián)或交叉偶聯(lián)反應(yīng)在多甲川鏈的中位引入C-C 鍵（烴基或苯基）[20-23]。通過取代基上新官能團的引入，以及對官能團的進一步衍生，可以極大的擴展染料的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖7 中位取代基不同的七甲川吲哚菁Fig. 7 The heptamethine cyanine with different substituent groups on the meso-position

Andrew Levitz 等[24]合成了中位取代基分別為溴、氯、甲基、苯基的七甲川吲哚菁，其λab分別為781 nm、780 nm、768 nm、759 nm。法國里昂大學(xué)Simon Pascal 等[25]結(jié)合TD-DFT 計算和實驗研究，分析了六元橋環(huán)上取代基對染料吸收光譜的影響，發(fā)現(xiàn)隨取代基給電子能力增強，多甲川鏈上的電荷由均分狀態(tài)逐漸過渡到集中分布狀態(tài)，不同中位取代基的七甲川吲哚菁的λab大小關(guān)系為：C-S＞C-Cl＞C-OR＞C-H＞C-NHPh＞C-NR2＞C-NHR＞C=CR2＞C=O＞C=NPh＞C=NR。

中位取代基不僅直接影響七甲川菁染料分子的性能，還可以通過其與分子共軛鏈結(jié)合，進一步調(diào)控分子在光穩(wěn)定性、熒光等方面的性能。Chen Hua 等[26]利用酚羥基取代七甲川吲哚菁的中位氯，得到了多例具有“氧雜蒽- 菁”結(jié)構(gòu)特征的熒光探針圖8（a-e）。相比母體分子，該類分子的吸收光譜發(fā)生大約60-80 nm 的藍移，而且在500-600 nm 出現(xiàn)一個小的肩峰，同時其光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率也有了較大的提升。而且該課題組在圖8（e）基礎(chǔ)上開發(fā)了一例H2S 的熒光增強型熒光探針圖8（f）。

圖8 具有“氧雜蒽-菁”結(jié)構(gòu)特征的七甲川菁熒光探針Fig. 8 The heptamethine cyanine with characteristic of‘xanthene-cyanine’structure

由于七甲川菁染料中位取代對分子性能影響較大，而且在拓展分子應(yīng)用領(lǐng)域方面也起著重要作用，因此，通過中位取代對染料分子進行衍生，可實現(xiàn)對次氯酸、鈀等小分子、離子的熒光檢測[27-29]，并在生物分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Liu ying 等[30]通過在多甲川鏈中位羰基上引入酰基，實現(xiàn)了在生物細胞內(nèi)線粒體自噬過程的測定；Zhao xiujie[31]通過在七甲川吲哚菁中位引入四苯乙烯，不僅有效避免了染料分子的聚集熒光淬滅，而且提高了其光熱轉(zhuǎn)化效率，成功將七甲川菁分子用做癌癥治療中的光熱轉(zhuǎn)化材料。

4 結(jié)論和展望

自ICG 被美國FDA 核準(zhǔn)應(yīng)用以來，關(guān)于七甲川菁染料在生物分析中的應(yīng)用研究方興未艾，但由于其自身在水溶性、光穩(wěn)定性、熒光量子產(chǎn)率等方面具有一定的缺陷，而且其自身可修飾點位較多，為其性能進一步優(yōu)化提供了較大空間。隨著對七甲川菁染料結(jié)構(gòu)調(diào)控研究的深入，自身結(jié)構(gòu)上的缺陷必將得到進一步彌補，如通過改變外部環(huán)境，調(diào)控分子的存在狀態(tài)，將七甲川菁染料與功能材料（如金屬氧化物溶膠、聚合物、表面活性劑）等復(fù)合，不僅可以有效改善其聚集性、熒光性能和光穩(wěn)定性，而且還可以擴展其應(yīng)用領(lǐng)域。其在生物分析、光電轉(zhuǎn)換等領(lǐng)域必將取得更好的應(yīng)用效果。尤其在生物分析領(lǐng)域，由于生物毒性小，無明顯副作用，對癌細胞具有良好的靶向和清除作用，已在生物影像、光熱轉(zhuǎn)化、光聲轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開發(fā)了多種性能優(yōu)異的七甲川菁染料，而且由于波長可調(diào)的特征，其在染料敏化太陽能電池等光電轉(zhuǎn)化領(lǐng)域也將得到一定的應(yīng)用。