鄭 宇,祝曉云*,張開(kāi)艷,余家奇,覃 成

(1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系,貴州 遵義 563000; 2.遵義華邦農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司,貴州 遵義 563000;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 第三人民附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563000)

花椒Zanthoxylumbungeanum屬蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum植物,主產(chǎn)區(qū)為四川、陜西和甘肅等[1]?；ń凡粌H是傳統(tǒng)的中藥材,還具有去膻去腥和增麻增香的作用,是一種典型的調(diào)味香料[2]。在川渝地區(qū),花椒是重要的經(jīng)濟(jì)作物,種植面積廣、產(chǎn)量高,花椒產(chǎn)業(yè)也是實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)[3]。貴州省將花椒產(chǎn)業(yè)作為林業(yè)特色產(chǎn)業(yè),且毗鄰川渝地區(qū),環(huán)境氣候大體一致,因此主要引進(jìn)重慶‘九葉青’‘藤椒’及四川‘漢源’等花椒品種進(jìn)行栽種。但地方小氣候仍會(huì)對(duì)昆蟲(chóng)的取食規(guī)律造成影響,因此評(píng)估引進(jìn)花椒的抗蟲(chóng)性具有十分重要的意義。

柑橘鳳蝶Papilioxuthus屬鱗翅目Lepidoptera鳳蝶科Papilionidae,主要分布于中國(guó)及緬甸、日本、韓國(guó)、菲律賓等東南亞國(guó)家地區(qū),在我國(guó)除新疆外的各省均有分布[4]。它雖然是種觀賞性很強(qiáng)的昆蟲(chóng),同時(shí)也是一種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)[5]。主要以幼蟲(chóng)寡食為害蕓香科植物葉片,如花椒、柑橘、黃檗、食茱萸等蕓香科植物[6]。多數(shù)情況下達(dá)不到需要防治的經(jīng)濟(jì)閾值,但進(jìn)入老熟幼蟲(chóng)階段的柑橘鳳蝶在化蛹前會(huì)有一個(gè)暴食期,在部分花椒種植區(qū)會(huì)造成花椒減產(chǎn)5%～10%[7]。

寄主植物可影響植食性昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、取食量和生理變化等,因此,研究害蟲(chóng)及其寄主植物的互作關(guān)系有助于掌握害蟲(chóng)種群動(dòng)態(tài)及制定防控治理措施[8]。有研究報(bào)道,與在紫花苜蓿、馬齒莧、灰綠藜、木地膚等7種寄主植物相比,牧草盲蝽Lyguspratensis若蟲(chóng)在花椰菜和四季豆適合度高,發(fā)育歷期最短,存活率最高[9]。草地螟Loxostegesticticalis幼蟲(chóng)的相對(duì)取食量、相對(duì)生長(zhǎng)率和食物利用率因取食不同寄主植物出現(xiàn)較大差異[10]。昆蟲(chóng)通常通過(guò)體內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,P450)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione Stransferases,GSTs)和羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)等解毒酶來(lái)抵御植物的化學(xué)防御[11]。取食大白菜后,甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲(chóng)的CarE活性最高,但如果以玉米Zeamays幼苗飼喂甜菜夜蛾幼蟲(chóng),CarE酶活性降低近60%[12]。昆蟲(chóng)消化酶是消化食物的重要蛋白,因此消化酶活性在一定程度上反映了昆蟲(chóng)所需營(yíng)養(yǎng)的種類及各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被昆蟲(chóng)利用的狀況[13]。分別以玉米、小麥和馬鈴薯葉片飼養(yǎng)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲(chóng),馬鈴薯葉片可導(dǎo)致草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)胃蛋白酶活性顯著升高[14]。

目前,對(duì)柑橘鳳蝶的研究主要集中在系統(tǒng)分化[15]、滯育[16]、蟲(chóng)體營(yíng)養(yǎng)成分分析[17]、蟲(chóng)體揮發(fā)物成分及觸角電位反應(yīng)[4]及發(fā)聲器的顯微結(jié)構(gòu)及防御作用[18]等方面,對(duì)于寄主影響柑橘鳳蝶的生長(zhǎng)發(fā)育及生理酶活性研究還知之甚少。本文以柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)為研究對(duì)象,比較初孵幼蟲(chóng)在本地花椒‘遵紅’和引進(jìn)的‘漢源’‘九葉青’‘藤椒’寄主上幼蟲(chóng)各齡期的體長(zhǎng)、頭殼寬、發(fā)育歷期,通過(guò)測(cè)定分析5齡幼蟲(chóng)取食量和解毒消化酶活性的差異,為評(píng)估柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)對(duì)引進(jìn)花椒的風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源及飼養(yǎng)條件

2019年8月,柑橘鳳蝶成蟲(chóng)采自貴州省遵義市綏陽(yáng)縣管理粗放的本地紅花椒‘遵紅’花椒園(E 107°16′,N 27°59′),帶回實(shí)驗(yàn)室并飼養(yǎng)在遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院教學(xué)用可控溫濕玻璃溫室并產(chǎn)卵于‘遵紅’花椒葉片上,連續(xù)飼養(yǎng)數(shù)代后,以足量初孵幼蟲(chóng)作為供試蟲(chóng)源,飼養(yǎng)條件為(25±1)℃、相對(duì)濕度(70±10)%、L∶D=16∶8。

1.2 花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

根據(jù)引種實(shí)際,本研究選取種植于玻璃溫室的本地花椒‘遵紅’和引進(jìn)的‘漢源’‘九葉青’‘藤椒’葉片作為供試寄主材料。待卵孵化后,用細(xì)毛筆將初孵幼蟲(chóng)挑出,轉(zhuǎn)入裝有不同花椒品種葉片飼養(yǎng)盒(長(zhǎng)×寬×高=60 cm×50 cm×45 cm)中單頭飼養(yǎng)。每個(gè)花椒品種處理30頭初孵幼蟲(chóng),重復(fù)3次。每天10∶00觀察1次,蛻皮后用細(xì)毛筆移除頭殼記為2齡幼蟲(chóng),以此類推,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄各幼蟲(chóng)齡期第2天的體長(zhǎng)和頭殼寬,幼蟲(chóng)化蛹后終止記錄,每天更換新鮮花椒葉片,統(tǒng)計(jì)不同齡期幼蟲(chóng)發(fā)育歷期。

1.3 花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)取食量的影響

柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)進(jìn)入暴食期,因此對(duì)不同寄主植物的取食量測(cè)定選取5齡第2天幼蟲(chóng)作為試驗(yàn)對(duì)象。將挑選出的柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)均分為3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)5頭幼蟲(chóng),測(cè)定并記錄各重復(fù)組取食前鮮葉、取食24 h后殘葉的重量,并用未接蟲(chóng)的葉片測(cè)算校正失水率。

取食量/g=(取食前葉片鮮重-食后葉片鮮重)/(1-校正失水率)。

1.4 花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)生理酶活性的影響

分別取1.2的柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)饑餓2 h后,選取個(gè)體大小一致的單頭幼蟲(chóng)用于解毒酶和消化酶活性的測(cè)定,每個(gè)處理3次重復(fù)。粗酶液的制備參照王秀吉等[19]制備方法:冰浴下解剖柑橘鳳蝶幼蟲(chóng),取出腸道,用冰冷的pH=7.2,0.1 M PBS緩沖液沖洗腸道后,立即放入滅菌離心管中,加入適量的PBS緩沖液稀釋,冰水浴中勻漿2 min破碎消化道組織,勻漿液于8000 g,4 ℃離心10 min,上清液即為粗酶液,分裝后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

解毒酶和消化酶活性測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(胃蛋白酶試劑盒編號(hào)A080-1-1、淀粉酶試劑盒編號(hào)C016-1-1、脂肪酶試劑盒編號(hào)A054-1-1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒編號(hào)A004-1-1、細(xì)胞色素P450酶試劑盒編號(hào)H303、羧酸酯酶試劑盒編號(hào)A133-1-1)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010記錄和整理數(shù)據(jù),原始數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,若存在顯著差異,則用Turkey法進(jìn)行多重比較,顯著水平為P<0.05,試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用Origin 2022軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)體長(zhǎng)和頭殼寬的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,取食不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)和頭殼寬有顯著差異,但影響的程度因該蟲(chóng)的齡期而異(圖1)。取食不同花椒品種葉片對(duì)柑橘鳳蝶1齡幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)和頭殼寬無(wú)明顯影響(P>0.05);自2齡起,取食‘九葉青’花椒后幼蟲(chóng)體長(zhǎng)和頭殼寬均顯著高于本地品種‘遵紅’花椒,‘藤椒’次之(P<0.05)。取食‘漢源’花椒僅在5齡幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)和4齡、5齡頭殼寬顯著大于取食‘遵紅’花椒(P<0.05)。

注:不同小寫(xiě)字母分別表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)發(fā)育歷期的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期有明顯影響(圖2)。取食‘九葉青’花椒的發(fā)育歷期最短,為15.63 d,顯著少于其他花椒品種(P<0.05);以‘遵紅’花椒飼養(yǎng),柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期最長(zhǎng),為21.70 d。其中,以‘九葉青’飼養(yǎng)的4齡(3.33 d)、5齡(4.20 d)幼蟲(chóng)發(fā)育歷期顯著短于以‘遵紅’花椒4齡(4.80 d)、5齡(5.83 d)飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)(P<0.05);花椒品種對(duì)3齡前柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖2 柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)取食不同花椒品種的發(fā)育歷期

2.3 不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)取食量的影響

柑橘鳳蝶5齡第2天幼蟲(chóng)對(duì)不同花椒品種的取食量存在差異(P<0.05)(圖3)。取食量由多到少依次為取食‘九葉青’(1.74 g)>‘藤椒’(1.26 g)>‘漢源’(0.62 g)>‘遵紅’(0.43 g)。

圖3 柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)在不同花椒品種上的取食量

2.4 不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)消化酶酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)消化酶的酶活有顯著差異(P<0.05)(圖4)。取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性高低順序?yàn)?‘九葉青’>‘藤椒’>‘漢源’>‘遵紅’。其中,胃蛋白酶和脂肪酶活性在4個(gè)品種之間均差異顯著(P<0.05),具體為胃蛋白酶活性高低順序?yàn)椤湃~青’(3.35)>‘藤椒’(3.16)>‘漢源’(2.59)>‘遵紅’(2.30),脂肪酶活性由高到低為‘九葉青’(1.47)>‘藤椒’(1.40)>‘漢源’(1.26)>‘遵紅’(1.05);淀粉酶活性在取食‘九葉青’和‘藤椒’分別與‘漢源’、‘遵紅’差異顯著(P<0.05),活性高低順序‘九葉青’(0.26)>‘藤椒’(0.21)>‘漢源’(0.17)>‘遵紅’(0.13)。說(shuō)明消化酶在柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)取食花椒的過(guò)程中起重要作用。

圖4 取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)消化酶活性

2.5 不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)解毒酶酶活性的影響

不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)解毒酶的酶活性影響無(wú)顯著差異(圖5)。取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450酶和羧酸酯酶的活性均無(wú)顯著變化(P>0.05)。說(shuō)明解毒酶在柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)取食花椒的過(guò)程中不起主要作用。

圖5 取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)解毒酶活性

3 結(jié)論與討論

寡食性昆蟲(chóng)可在幾種或多種寄主植物間遷移危害,不同寄主植物具有不同營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成和次生代謝物質(zhì),反映在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、取食繁殖及體內(nèi)生理、生化指標(biāo)等方面。為更好地生存和繁殖,昆蟲(chóng)需要不斷提高自身對(duì)寄主植物的適應(yīng)能力[20]。

本研究選取了在‘遵紅’花椒上培育的初孵柑橘鳳蝶幼蟲(chóng),分別以‘遵紅’、‘漢源’、‘九葉青’和‘藤椒’為寄主植物完成幼蟲(chóng)發(fā)育階段。結(jié)果表明,取食‘九葉青’花椒后幼蟲(chóng)體長(zhǎng)和頭殼寬均顯著高于取食本地‘遵紅’花椒品種,且在‘九葉青’花椒上最快完成幼蟲(chóng)的發(fā)育;另外,體長(zhǎng)、頭殼寬、發(fā)育歷期顯著性差異均較為一致的出現(xiàn)在暴食期(4齡或5齡老熟幼蟲(chóng)),說(shuō)明不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)發(fā)育歷期主要集中在對(duì)老熟幼蟲(chóng)(4齡和5齡)發(fā)育歷期的影響,柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)對(duì)‘九葉青’具有較好的適應(yīng)性。柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)進(jìn)入暴食期為化蛹做準(zhǔn)備,進(jìn)一步說(shuō)明柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)對(duì)‘九葉青’具較好的適應(yīng)性。以上結(jié)果說(shuō)明,‘九葉青’花椒較其他花椒品種更適合柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育,暴食期的幼蟲(chóng)體長(zhǎng)、頭殼寬、取食量均顯著增加,可能在為快速化蛹從而縮短發(fā)育歷期做能量物質(zhì)的積累。類似的研究表明,采用不同的食料植物葉片飼養(yǎng)美國(guó)白蛾Hyphantriacunea幼蟲(chóng),4齡后的累積取食量達(dá)到總?cè)∈沉康?5%以上[21]。桃小食心蟲(chóng)Carposinasasakii的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖在不同寄主植物間存在顯著差異[22]。桃和蘋果更適宜蘋小卷葉蛾Adoxophyesorana的發(fā)育及繁殖[23]。

生理酶在植食性昆蟲(chóng)取食植物起重要作用,首先解毒酶作用于昆蟲(chóng)抵御植物的化學(xué)防御過(guò)程,當(dāng)昆蟲(chóng)克服植物的防御屏障后,還需要消化酶進(jìn)一步進(jìn)行組織的分解和營(yíng)養(yǎng)的吸收[24]。本研究表明,取食不同花椒品種對(duì)柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)GSTs、P450、CarE等解毒酶的活性均無(wú)顯著影響。這與寄主對(duì)小線角木蠹蛾Streltzoviellainsularis幼蟲(chóng)解毒酶的影響結(jié)果不一致,本文的結(jié)果為取食普通寄主(旱柳、欒樹(shù)、香椿、毛桃)的幼蟲(chóng)3種解毒酶的平均活性均高于取食喜食寄主(洋白蠟、銀杏、國(guó)槐)的幼蟲(chóng)[19]。原因可能是因?yàn)楸狙芯克婕暗募闹髦参锞鶠榛ń?只是品種的不同,不同花椒品種的防御昆蟲(chóng)的過(guò)程相同,研究團(tuán)隊(duì)后期將針對(duì)這一方面開(kāi)展深入研究。但是,取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)消化酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)的酶活有顯著差異。

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的功能是將植物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為能被昆蟲(chóng)吸收的小分子蛋白,這些酶類是評(píng)價(jià)寄主植物被昆蟲(chóng)利用的狀況以及昆蟲(chóng)和寄主植物之間的相互適應(yīng)性重要參考[13,25]。因此,本研究結(jié)果可推測(cè)出柑橘鳳蝶對(duì)‘九葉青’具較好的適應(yīng)性,蟲(chóng)體內(nèi)消化酶可能是其對(duì)‘九葉青’有較好適應(yīng)性的主要原因。類似研究表明,在取食營(yíng)養(yǎng)成分含量高的寄主植物時(shí),金銀花尺蠖Heterolochajinyinhuaphaga幼蟲(chóng)通過(guò)提高自身消化酶活性分解大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以保證機(jī)體的快速生長(zhǎng)[26]。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella幼蟲(chóng)取食適宜寄主植物體內(nèi)蛋白酶活性最高,取食適宜寄主植物體內(nèi)蛋白酶活性也處于較高水平,可能是幼蟲(chóng)將蛋白質(zhì)水解為氨基酸,為機(jī)體提供氮源有關(guān)[27]。取食柳杉與柏木的云南松毛蟲(chóng)Dendrolimushoui幼蟲(chóng)體內(nèi)蛋白酶活性均處于較高水平,因此云南松毛蟲(chóng)對(duì)柳杉和柏木具較好的適應(yīng)性[28]。酶活力測(cè)定法比較了桑粉虱Bemisiamyricae6種寄主植物(桑樹(shù)、黃瓜、煙草、菜豆、馬鈴薯、番茄)田間種群的酶活結(jié)果為乙酰膽堿酯酶活力桑樹(shù)種群與其他種群相比差異顯著或極顯著,羧酸酯酶的活性桑樹(shù)粉虱種群與番茄種群相比差異顯著或極顯著,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性是桑樹(shù)種群最高,顯著高于其他植物粉虱種群[29];不同寄主植物對(duì)斜紋夜蛾Spodopteralitura初孵幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期、存活率、蛹重、繁殖率有較大差異,斜紋夜蛾對(duì)不同寄主植物表現(xiàn)出不同的喜好性[30]。對(duì)比蘿卜蚜Lipaphiserysimi在不同寄主上的適合度,結(jié)果表明蘿卜最適合蘿卜蚜生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖,甘藍(lán)不利于其繁殖[31]。

本研究表明柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)對(duì)‘九葉青’花椒品種有較好的適應(yīng)性,體現(xiàn)在較大的體長(zhǎng)和頭殼寬、較短發(fā)育歷期和5齡幼蟲(chóng)較大的取食量,蟲(chóng)體內(nèi)的消化酶(胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)可能是其適應(yīng)‘九葉青’的主要原因。這些研究結(jié)果可為評(píng)估‘九葉青’引種栽培后的抗柑橘鳳蝶的風(fēng)險(xiǎn)和防治提供參考。