鄭文格,黃立明,劉婉煜,陳 瑩,張 華,趙春芳,2,余龍江,2,付春華,2*

(1.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所,湖北 武漢 430074;2.華中科技大學(xué) 分子生物物理教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074)

紫杉醇是世界公認的高效低毒類治療腫瘤的有效藥物,在臨床上廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤的治療[1],但目前紫杉醇原料藥的產(chǎn)量遠遠不能滿足癌癥患者的需求,市場上供不應(yīng)求[2]。目前,紫杉醇主要從紅豆杉屬(Taxus)植物的針葉中直接提取,或者從針葉中提取前體物質(zhì)后進行化學(xué)半合成獲得。為了緩解紫杉醇原料藥的短缺問題及保護野生紅豆杉資源,國內(nèi)多地已經(jīng)建立了紅豆杉人工種植基地。在紅豆杉人工種植過程中,炭疽病是其幼苗普遍發(fā)生的病害之一,主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起,在拱棚或者大棚里發(fā)病更嚴重,發(fā)病率為15%～30%,導(dǎo)致扦插苗干枯壞死,給農(nóng)戶和企業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[3-4]。

目前,化學(xué)殺菌劑仍然是防治炭疽病的主要策略[5],但化學(xué)殺菌劑中一些化學(xué)物質(zhì)對人類的健康構(gòu)成潛在風(fēng)險[6],同時濫用農(nóng)藥會減少土壤中有益菌的數(shù)量,造成土壤養(yǎng)分流失[7-8],除此之外,由于農(nóng)藥的不規(guī)范使用,部分病原菌呈現(xiàn)出抗藥性[9]。以上問題使得部分化學(xué)農(nóng)藥逐漸退出市場,促使人們尋找更為安全可靠的病害防治方法。

生物防治是一種很有前景的病害防治策略,它是指利用一種生物防治另一種生物的方法。例如利用拮抗微生物對植物病原菌進行抑制,使其數(shù)量減少或者破壞性降低[10],既能達到抑制病原菌的效果,又不會破壞生物多樣性,以及造成環(huán)境污染。自然界中有很多微生物對病原菌有顯著抑制作用,被用于作物病害的生物防治,如芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等[11-14]。目前已有多種生物防治劑上市[15-16],但有關(guān)紅豆杉炭疽病的生物防治研究未見報道。

在多種具有開發(fā)為生物防治劑潛力的微生物中,根際益生菌由于兼具防病與促生的雙重作用被人們普遍關(guān)注,如Bashan等[17]發(fā)現(xiàn)根際益生菌能夠防治番茄葉面細菌性斑點病,并改善植物的生長;Tortora等[18]發(fā)現(xiàn)根際益生菌能夠通過提高寄主的抗性從而減輕草莓炭疽病的發(fā)病癥狀;而紅豆杉幼苗容易感染炭疽病的原因之一就是抵抗力較低,因此,通過根際益生菌對紅豆杉炭疽病進行防治是一種可行且具可持續(xù)發(fā)展優(yōu)勢的策略。

磷是植物正常生長所需的一種重要營養(yǎng)元素之一,土壤中的磷大部分是以不溶的形式存在,不能被植物有效吸收利用[19],一些促生菌能夠通過釋放有機酸或分泌胞外磷酸酶等途徑釋放土壤中的不溶性磷,從而使植物更加有效地利用土壤中的磷元素,促進自身生長。IAA(吲哚-3-乙酸)是天然存在于植物中最具生理活性的生長素之一,適宜濃度的IAA能夠誘導(dǎo)植物側(cè)根和不定根的形成,提高根毛數(shù)量,從而使植物更有效地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分[20-21]。鐵是一種微量營養(yǎng)元素,它對植物的一些生理活動至關(guān)重要,缺鐵會導(dǎo)致植物黃化、代謝活性和生物量降低;嗜鐵素是微生物在低鐵條件分泌的一類高度專一的鐵螯合因子,與環(huán)境中的Fe3+結(jié)合形成穩(wěn)定的鐵載體-鐵復(fù)合物,此復(fù)合物通過與細胞膜上相應(yīng)的特異受體結(jié)合將鐵運輸?shù)桨麅?nèi),從而滿足生物體對鐵的需求[22]。而根際益生菌一般都兼具一種或多種促生能力(包括溶磷、產(chǎn)IAA和分泌嗜鐵素等)。

本研究以紅豆杉炭疽病菌為靶標菌,從健康紅豆杉根際土壤中分離篩選拮抗微生物,并通過平板對峙試驗以及盆栽防病試驗評估其拮抗能力,同時通過溶磷、產(chǎn)IAA和分泌嗜鐵素等試驗以及紅豆杉枝條扦插生根試驗探究其對紅豆杉的促生作用,以期為紅豆杉炭疽病的生物防治提供試驗依據(jù)和優(yōu)良的益生菌株。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

健康曼地亞紅豆杉根際土壤、5月齡紅豆杉盆栽苗,均取自湖北省孝感市湖北鄧家河莊園股份有限公司紅豆杉種植基地。

靶標菌:膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)由發(fā)病的曼地亞紅豆杉葉片中分離獲得。

1.2 紅豆杉根際微生物的分離純化

參照崔曉雙[23]的方法稍作改動:制備健康曼地亞紅豆杉根際土壤懸浮液,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,分別吸取200 μL稀釋梯度為10-5、10-6、10-7的懸液涂布于LB培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d,挑取培養(yǎng)基中生長旺盛、形態(tài)不同的菌落進行劃線純化。

1.3 炭疽病原菌拮抗菌的篩選

1.3.1炭疽病原菌拮抗菌初篩

參照呂婷[24]的方法稍作改動:用打孔器取直徑為6 mm的病原菌菌餅置于PDA平板中央,將細菌懸浮液點接在距平板中央3 cm處的4個點上,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,選擇能夠抑制病原菌生長的菌株作為復(fù)篩對象。

1.3.2炭疽病原菌拮抗菌復(fù)篩

參照Niu等[25]的方法稍作改動:用打孔器取直徑為6 mm的菌餅放置在距PDA平板邊緣2 cm處,取10 μL活化菌液于平板中間劃線,大腸桿菌DH5α作為對照。生長7 d后,記錄病原菌菌落半徑,并計算抑菌率。試驗重復(fù)3次。

1.4 拮抗菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

利用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。以提取的總DNA為模板,使用通用引物27F、1492R對菌株的16S rDNA基因進行PCR擴增(表1)。將擴增序列連接到T載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,利用通用引物M13F(-47)和M13R(-48)(表1)擴增驗證,陽性單克隆送武漢奧科有限公司測序。

表1 通用引物序列

將16S rDNA序列上傳至Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(www.ezbiocloud.net)進行比對分析[26],下載親緣關(guān)系較近的模式菌株的16S rDNA基因序列,通過MEGA7.0將待鑒定菌株與模式菌株的16S rDNA基因序列校正對齊后用鄰近連接法(Neighbour-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.5 拮抗菌對紅豆杉炭疽病的防效評價

使用5月齡紅豆杉盆栽扦插苗,采用噴霧法進行防效評價[27]:按1%的接種量將活化好的拮抗菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液稀釋至濃度為1×1010個/mL,制成拮抗菌懸浮液。挑取病原菌的菌絲接種于50 mL PDA液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d,制備病原菌懸浮液,分生孢子濃度為1×106個/mL。其中分生孢子數(shù)采用血球計數(shù)板計數(shù),拮抗菌濃度利用分光光度計來測定。

設(shè)置LB液體培養(yǎng)基組、拮抗菌懸浮液組、40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑4000倍液組等3組,每株5 mL,分別噴霧接種于紅豆杉苗地上部分。24 h后將病原菌懸浮液噴施于上述3組不同處理的植株上。每組處理30株扦插苗。人工培養(yǎng)室條件設(shè)定為光周期12 h/12 h(白天/夜晚),空氣相對濕度85%,溫度27～30 ℃。培養(yǎng)15 d后調(diào)查發(fā)病情況。參照炭疽病病害分級(表2)計算病情指數(shù)和防治效果[28],計算公式如下:

表2 炭疽病病情的分級標準

1.6 拮抗菌促生能力的測定

溶磷能力采用鉬銻抗比色法[29]進行測定;IAA(吲哚乙酸)分泌能力采用Salkowski Reagent比色法[30]進行測定;產(chǎn)嗜鐵素能力采用CAS平板法[31-32]進行測定。

1.7 拮抗菌對紅豆杉枝條扦插生根的促生作用

將拮抗菌菌液OD600值調(diào)為0.5備用。選取生長健壯、無病蟲害的紅豆杉枝條,剪取10 cm左右1～2 a生半木質(zhì)化(綠色或黃綠色)插條,直徑3 mm左右;去掉枝條下端大約1/3的葉片,分為5組(每組10根枝條),分別將枝條基部浸泡到清水、生根粉溶液(200 mg/L)、MK18菌液、MK128菌液,以及MK18和MK128混合菌液中,浸泡2 h,菌液濃度均為1×1010個/mL;浸泡后將枝條插入清水中,深度3～4 cm;初期用小噴壺葉面噴水,溫室內(nèi)平均氣溫23～26 ℃,平均相對濕度50%。6個月后統(tǒng)計生根數(shù)量和根長。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行處理,利用Origin 2021進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際微生物的分離純化與拮抗菌的篩選

從健康紅豆杉根際土壤中共分離得到100余株可培養(yǎng)菌株,通過平板對峙試驗篩選拮抗菌(圖1)。結(jié)果表明,不同拮抗菌的菌落大小有明顯差異,菌落比較大的菌株看起來像是減小了病原菌的半徑,但隨著培養(yǎng)時間延長,病原菌的菌絲就會越過菌落繼續(xù)生長,因此,該種拮抗菌并未真正抑制病原菌。而菌落比較小的菌株如17號菌株不接觸病原菌即能抑制菌絲的生長,可能是因為菌株分泌了抗菌物質(zhì),抗菌物質(zhì)通過培養(yǎng)基擴散從而持續(xù)抑制病原菌的生長。共有5株菌能夠顯著抑制病原菌的生長,編號分別為17、44、30、128、18。

注:圖中數(shù)字表示菌株編號。

為了消除菌株通過“物理屏障”作用短暫阻擋病原菌生長的可能,本試驗用DH5α作為對照,對上述5株菌的拮抗作用進一步復(fù)篩驗證。結(jié)果表明,菌株18、17、30、128能夠顯著抑制病原菌的生長(圖2-a),抑菌率分別為39.22%、47.06%、56.86%、56.86%(圖2-b),將上述4株菌分別命名為MK18、MK17、MK30、MK128。

注:*表示顯著差異(P<0.05);**表示極顯著差異(P<0.01);ns表示無顯著差異(P>0.05)。

2.2 拮抗菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用4株菌的16S rDNA基因序列進行NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)MK17與Burkholderiastabilis聚為一支,鑒定MK17為穩(wěn)定伯克霍爾德菌(Burkholderiastabilis);MK30和MK128與Burkholderiapyrrocinia聚為一支,鑒定MK30與MK128為吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)(圖3);MK18與Paraburkholderiacaffeinilytica聚為一支,鑒定MK18為耐咖啡因副伯克霍爾德氏菌(Paraburkholderiacaffeinilytica)(圖4)。

圖3 菌株MK30、MK17、M128與近緣種16S rDNA基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株MK18與近緣種16S rDNA基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗菌對紅豆杉炭疽病的防效評價

分別考察了拮抗菌單獨或者聯(lián)合不同添加劑對紅豆杉炭疽病的防治效果。與只噴施病原菌懸浮液相比,噴施MK18、MK30、MK128、MK17以及化學(xué)殺菌劑苯醚甲環(huán)唑均能顯著降低炭疽病的病情指數(shù)(圖5-a,5-b),防治率分別為29.42%、30.89%、30.89%、36.77%和64.71%(圖5-c)。并且,MK128菌液中分別加入阿拉伯膠(GA)、吐溫-20(T20)、抗壞血酸(VC)以及三者混合加入后,紅豆杉炭疽病的病情指數(shù)進一步降低(圖5-d),防治率依次達到了54.41%、55.88%、55.88%和63.24%,3種添加劑同時使用時,其防治效果與苯醚甲環(huán)唑相當(圖5-e)。

注:a.拮抗菌對炭疽病的防效表現(xiàn);b.不同拮抗菌處理后炭疽病病情指數(shù);c.不同拮抗菌處理炭疽病防治效果;d.MK128菌液中加入不同添加劑處理后炭疽病病情指數(shù);e.MK128菌液中加入不同添加劑對炭疽病防治效果;GA為阿拉伯膠;VC為抗壞血酸;T20為吐溫-20;*表示顯著差異(P<0.05);**表示極顯著差異(P<0.01);ns表示無顯著差異(P>0.05)。

2.4 拮抗菌促生潛能評價

采用鉬銻抗比色法檢測菌株發(fā)酵液中有效磷含量,菌株溶磷能力越強,發(fā)酵液中有效磷含量越高。溶磷活性測定試驗結(jié)果表明,4株拮抗菌株均具有良好的溶磷能力(表3),其中菌株MK128溶磷能力最強,溶磷量為6.16±0.09 mg/L。在產(chǎn)IAA試驗中,4株拮抗菌株在與比色液結(jié)合后有2株呈現(xiàn)出不同深度的紅色,表明這2株菌株具有分泌IAA的能力,紅色越深表示分泌IAA的能力越強;其中菌株MK18分泌IAA的量可達21.03±0.20 mg/L(表3)。CAS平板培養(yǎng)試驗結(jié)果表明,菌株MK128分泌嗜鐵素的能力最強,D/d值為2.45±0.03(表3)。

表3 拮抗菌促生能力評價

2.5 拮抗菌MK18和MK128對紅豆杉枝條扦插生根的促生評價

分別考察了4株拮抗菌單獨處理紅豆杉插條后的促生效果,結(jié)果表明,相對生根粉處理,MK18和MK128單獨及聯(lián)合處理均能顯著促進紅豆杉插條生根(圖6),且雙菌聯(lián)合處理促生效果最優(yōu),平均根長達到了5.75 cm,而MK128在促進根的生長方面有一定優(yōu)勢(表4)。因此,本研究獲得了2株對紅豆杉生長有促進作用的益生菌。

圖6 M18和MK128對紅豆杉枝條的促生根效果

表4 M18和MK128對紅豆杉枝條的促生根效果評價

3 結(jié)論與討論

本文以膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)為靶標菌,通過平板對峙從健康曼地亞紅豆杉根際土壤中篩選出4株拮抗效果明顯的菌株(MK17、MK18、MK30和MK128),抑菌率均在39%以上,其中MK30和MK128抑菌率最高,達到了56.86%。在室內(nèi)盆栽防效試驗中,4株拮抗菌對紅豆杉炭疽病均具有一定的防治作用。有研究[33-34]發(fā)現(xiàn),粘合劑阿拉伯樹膠在溶液中可起到增稠、穩(wěn)定、保水等作用,可提高菌株的定殖率;抗壞血酸能清除自由基,可防止菌株及菌液中物質(zhì)的過氧化;乳化劑吐溫-20能夠提高溶液的濕潤度,可保持乳液的均勻懸浮和穩(wěn)定性。因此,本研究在MK128中加入阿拉伯膠、吐溫-20和抗壞血酸,防治效果得到了大幅提升,達到了63.24%,防治效果與苯醚甲環(huán)唑相當。同時,在溶磷、產(chǎn)IAA、分泌嗜鐵素等試驗中,4株拮抗菌均表現(xiàn)出一種及以上的促生活性,其中MK128同時具有溶磷和分泌嗜鐵素能力,且均最強,MK18分泌IAA能力最強。在紅豆杉插條水培生根試驗中,MK18和MK128分別處理以及聯(lián)合處理均能顯著促進紅豆杉插條生根,平均生根數(shù)以及平均根長分別是生根粉處理的2.64～3.14倍以及1.19～1.42倍。以上研究結(jié)果表明,菌株MK18和MK128均具有拮抗與促生雙重作用,可作為紅豆杉炭疽病生物防治潛在的益生菌株。

MK17、MK30和MK128均為伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)成員,伯克霍爾德菌具有多種促進植物生長的作用機制,如固氮、解磷,產(chǎn)IAA、分泌嗜鐵素等;此外,該屬有多個種被報道對植物病原菌有抑制作用,不僅可以通過拮抗作用降低病原體的活性,還可以誘導(dǎo)植物進行自我防御[35]。MK18為副伯克霍爾德菌屬(Paraburkholderia)成員之一,該屬也有多種菌被證實為植物有益菌,如Hane等[36]報道吩嗪副伯克霍爾德菌(Paraburkholderiaphenazinium)能夠促進硬葉蔥草幼苗的生長,并且發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似于IAA的主要代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸可能發(fā)揮著主要作用。伯克霍爾德菌屬與副伯克霍爾德菌屬均屬于變形菌門(Proteobacteria)、β變形菌綱(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)的成員,Wang等[37]對伯克霍爾德菌屬和副伯克霍爾德菌屬進行了基因組分析,在這兩個屬的促生菌成員中都發(fā)現(xiàn)了與固氮、生長素合成相關(guān)的基因。副伯克霍爾德菌屬除了具有促進植物生長的能力外,也能誘導(dǎo)植物抵抗生物和非生物脅迫[38]。紅豆杉幼苗易感染炭疽病的原因之一就是抵抗力不足,而本試驗篩選的菌株MK18和MK128不僅能直接抑制病原菌的生長,還具有分泌IAA或溶磷和分泌嗜鐵素的能力,具有潛在誘導(dǎo)植物防御、促進植物生長的能力,因此,菌株MK18和MK128具有很強的防治炭疽病的潛力,有望進一步開發(fā)為紅豆杉炭疽病的生防制劑。本研究為紅豆杉炭疽病的生物防治提供了試驗依據(jù)和優(yōu)良的益生菌株。