曹燕珍，圖蓀阿依·吾麥爾，胡佳捷，楊麗麗，房新志

0 引言

2020年，全球將近有60萬食管癌新發(fā)病例和54萬例食管癌死亡病例，分別位于全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡排名的第7位和第6位[1]，而食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是食管癌最常見的組織學亞型。腸道菌群被稱為人體的另一大“器官”，其人體消化、代謝、免疫等各方面都有重要作用[2]。腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門四大類組成[3]，其中在健康狀態(tài)下，超過80%的腸道微生物組是由專性厭氧菌組成的，屬于厚壁菌和擬桿菌，少于5%屬于變形菌門[4]，微生物群落之間比例的顯著變化或新細菌群的擴張以及功能的改變，可導致宿主和微生物間相互作用的不平衡，進而引起菌群失調[5]。有研究表明，以厚壁菌門，尤其是產(chǎn)丁酸鹽的菌種巨大消耗是消化道腫瘤腸道菌群組成的主要形式，可導致食管鱗狀細胞癌、胃癌等消化道腫瘤的發(fā)生[6]，與腸道微生物組相比，關于食管微生物組的研究是有限的，需進一步研究[7]。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院2019年1月—12月胃鏡下活檢確診的食管鱗狀細胞癌患者30例，其中男21例、女9例；同期收集健康體檢者25例為對照組，其中男18例、女7例。食管鱗狀細胞癌組平均年齡62.03±10.51歲，健康對照組46.28±12.90歲。兩組人群中均為新疆本地居民，所有患者在采樣前1個月均未使用過抗生素藥物。食管鱗狀細胞癌的診斷依據(jù)食管癌診療規(guī)范（2018年版）[8]。本研究所有患者均知情同意，并獲得新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準（K-2019022）。

1.2 方法

1.2.1 微生物擴增子測序法 擴增子測序在微生物生態(tài)學研究中被用于探索微生物群落，是一種半定量方法，揭示了微生物群落中細菌群體的相對豐度。細菌的16srRNA基因是最廣泛使用的針對微生物組檢查的擴增子，具體實驗步驟見圖1。

圖1 微生物擴增子測序法步驟Figure 1 Experimental procedures of microbial amplification sequencing

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 Trim Galore軟件除去序列最末端質量低于20的堿基，去除可能包含的adapter序列，之后去除小于100 bp的短序列[15]；FLASH2軟件拼接雙側末端測序得到的成對序列，得到merge序列；用Mothur軟件查找并去除序列中的引物[15]；用Usearch去除總堿基錯誤率大于2的序列以及長度小于100 bp的序列[15]。

1.3 統(tǒng)計學方法

Alpha多樣性采用Observed指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和coverage指數(shù)進行評價，基于Wilcoxon秩和檢驗兩組間多樣性指數(shù)差異[16]。采用非度量多維尺度分析（NMDS）及主坐標分析（PCoA）評估Beta多樣性[17]。多樣性分析使用R軟件進行，LEfSe軟件篩選最可能解釋組間差異的物種，使用Metastats進行組間相對豐度的分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸道菌群多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析 R軟件對兩組進行Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)比較，秩和檢驗顯示兩組間多樣性指數(shù)均無差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 Alpha多樣性指數(shù)箱Figure 2 Boxplot of alpha-diversity indices

2.1.2 Beta多樣性分析NMDS及PCoA 分析食管鱗狀細胞癌患者組與健康對照組Beta多樣性，兩組間有較大的相似性，但存在一定差異。其中PCoA分析使用基于加權UniFrac距離分析的PCoA圖來評估β多樣性，展現(xiàn)樣本間物種豐度差異，見圖3。

圖3 NMDS及PCoA分析圖Figure 3 NMDS and PCoA analysis charts

2.2 LEfSe差異性物種篩選

據(jù)LEfSe差異性分析，兩組樣本之間存在顯著性差異，以|LDA|＞2，P＜0.05為差異篩選閾值，可得到兩組間有62個物種存在差異顯著性的豐富度，見圖4。

圖4 兩組人群LEfSe差異性分析柱狀圖Figure 4 Histogram of LEfSe difference analysis between the two groups

2.3 健康對照組與食管鱗狀細胞癌組糞便菌群相對豐度比較

食管鱗狀細胞癌組患者變形菌門Proteobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia的相對豐度高于健康對照組（P＜0.05）；食管鱗狀細胞癌組患者Megamonas屬的相對豐度低于健康對照組（P=0.025），其余相對豐度見表1。

3 討論

食管癌是多種因素共同作用的結果，本研究主要探討菌群結構與食管鱗狀細胞癌的關系，盡管菌群與一些疾病的因果關系尚不確切[18]，有研究[19]表明腸道微生物菌群對食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中有著不可忽視的影響，可以保護宿主組織免受病原入侵，并有助于食管黏膜屏障的結構完整性。還有研究表明[20]，上消化道的微生物豐富度較低與食管鱗狀細胞發(fā)育不良有關，這被認為是ESCC的前體病變。特定細菌的聯(lián)合作用促進腸道炎性反應和癌癥，細菌形成的生物膜為癌細胞提供了庇護所[21]，而目前研究較多的腸道微生物是梭桿菌，食管鱗狀細胞癌可能與具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌感染相關[22]，而這些細菌的存在與食管鱗狀細胞癌患者生存時間縮短有關[23-24]。本研究中梭桿菌門未做出有意義的菌屬，可能與樣本量較少有關。

Alpha多樣性指數(shù)中，Chao1指數(shù)主要反映群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于體現(xiàn)腸道菌群落的均勻程度，即各菌落的豐度差異[25]。本研究結果顯示，兩組菌群Alpha多樣性無統(tǒng)計學差異，這與劉曉波等[26]研究結果一致，提示食管鱗狀細胞癌患者與健康患者菌群間總體多樣性無明顯差異；Beta反映的是不同個體菌落結構的相似程度，樣本集中則提示有較高的聚集性。NMDS和PCoA分析通過降維方法，表現(xiàn)各樣本的距離分布，對結構復雜的數(shù)據(jù)排序結果的顯示更加穩(wěn)定[27]。本研究Beta多形性結果顯示，兩組微生物多樣性呈相似性趨勢，這與Zhao等[28]研究結果一致。NMDS和PCoA分析展現(xiàn)樣本間物種豐富度存在差異，說明食管鱗狀細胞癌患者與健康人群腸道菌群落豐富度存在一定的差異。

本研究結果發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌患者變形菌門的相對豐度顯著高于健康對照組，與已有研究[29]結果一致，這可能與食管反流可引起食管黏膜壁損傷，使食管上皮細胞處在微生物滋生環(huán)境中，導致了慢性炎性反應的發(fā)生有關，而慢性炎性反應是食管進展為食管鱗狀細胞癌的重要危險因素[30]。疣微菌門可能促進腸道黏膜破壞，增加腸道通透性，導致脂多糖進入血液并遷移到食管組織，與TLR4等受體結合，影響NF-κB信號通路從而引起食管鱗狀細胞癌[31]。正常人體消化道菌群98%以上為厚壁菌門和擬桿菌門[32]，食管鱗狀細胞癌組患者厚壁菌門Megamonas屬的相對豐度則低于健康對照組，這與Nasrollahzadeh等研究結果相反，可能與食管炎性反應及腫瘤的發(fā)生導致厚壁菌門中的一些菌豐富度降低有關[33]。

大多數(shù)情況下，微生物菌群與宿主和諧相處，通常處于共生狀態(tài)。然而，在某些情況下，這種共生關系可能會破裂。菌群失調將導致有害菌群豐度增高，有益菌群豐度減少，產(chǎn)生致癌性代謝產(chǎn)物及細胞因子[34]，然而食管鱗狀細胞癌特定菌株及其代謝物仍然未知，需進一步研究。本研究通過對腸道菌群結構與組分的變化研究來探索，結果表明其可以作為一個準確、靈敏的食管癌生物學診斷指標，為食管鱗狀細胞癌的診療提供新的途徑。然而，由于本研究樣本量少，沒有對患者年齡、性別、病理分期等進一步分析以及兩組人群特定的地理位置、長期飲食習慣及實驗技術等方面的問題也可能會造成差異[35]，因此，需要后續(xù)研究來探討食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展與定植菌群結構與組分變化的機制，為今后食管鱗狀細胞癌的診療提供更加有效的方法。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。