陳前智，沈娜，張寧，陳嫣

0 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥死亡的主要原因之一。2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌已超過肺癌，成為最常見的癌癥，估計有230萬新病例，其中乳腺癌死亡人數(shù)占癌癥死亡總數(shù)的6.9%[1]。遠處轉移是乳腺癌死亡的主要原因[2-3]。盡管乳腺癌生物學研究的進步促使了分子靶向治療和內分泌藥物的廣泛應用，但由于乳腺癌的復雜性和異質性，與乳腺癌細胞侵襲轉移調控相關的分子機制目前尚不清楚[4-5]。因此，尋找新的乳腺癌侵襲轉移機制及相關靶向治療藥物迫在眉睫[6-7]。線粒體絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT2）是一種線粒體代謝酶，在維持正常甲基化模式、DNA穩(wěn)定性和遺傳變異方面起關鍵作用[8]。SHMT2催化細胞內甘氨酸生物合成對細胞生長和增殖至關重要，異常的SHMT2促進了代謝的變化，從而增強了腫瘤細胞在缺血微環(huán)境中的生存能力[9]。已有研究表明，SHMT2在乳腺癌、胃癌、食管癌和結直腸癌等組織中的mRNA和蛋白水平均顯著高于配對的癌旁組織，而且在不同腫瘤中SHMT2可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲能力[10]。本研究進一步驗證并發(fā)現(xiàn)SHMT2在乳腺癌組織中表達顯著高于癌旁組織，而且在腫瘤細胞中敲減SHMT2基因可抑制其侵襲遷移能力。本研究以探索SHMT2調控乳腺癌侵襲遷移的分子機制為研究目標，擬發(fā)現(xiàn)新的分子調控機制和潛在干預靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；高速低溫離心機購自美國Eppendorf公司；普通倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；蛋白印跡實驗裝置購自美國Bio-Rads公司。

MCF7、HEK293T是源于ATCC的凍存細胞株，細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司。蛋白印跡實驗制膠試劑和NP40細胞裂解液購自武漢啟動子公司；轉染試劑Turbo-Fect（貨號：R0531）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（貨號：23225）、ECL顯影液（貨號：34577）購自美國Thermo Fisher公司；GAPDH抗體（貨號：60004-1-Ig）、SHMT2抗體（貨號：11099-1-AP）、HAX1抗體（貨號：11266-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；SHMT2抑制劑（SHIN1，貨號：RZ-2994）購自美國MCE公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫篩選及數(shù)據(jù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載并整理TCGA-BRCA（乳腺浸潤癌）項目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)。根據(jù)數(shù)據(jù)格式特征情況選擇合適的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計（運用R語言stats包以及car包），用ggplot2包對數(shù)據(jù)進行可視化，分析不同組織蛋白表達的差異水平。統(tǒng)計方法：Wilcoxon rank sum test。

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理TCGA-BRCA（乳腺浸潤癌）項目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。使用R語言的survival包進行比例風險假設檢驗并進行擬合生存回歸，結果用survminer包以及ggplot2包進行可視化，分析不同蛋白表達的生存預后情況。統(tǒng)計方法：Log rank檢驗。

1.3 細胞培養(yǎng)及質粒轉染

MCF7細胞株為本實驗前期購自美國ATCC細胞庫，于-80℃冰箱超低溫保存。MCF7細胞用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內，用0.25%胰酶進行消化傳代。敲低質粒（shSHMT2#1和#2）和高表達質粒（Flag-SHMT2、HA-HAX1）均購自中國吉凱基因公司。在MCF7細胞生長進入對數(shù)期后，用TurboFect試劑轉染敲低或高表達質粒，孵育48 h后進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞侵襲能力檢測

將Transwell小室用不含血清的DMEM培養(yǎng)基激活后置于24孔板中。吸除培養(yǎng)基后在小室上層加入50 μl基質膠，靜置30 min。將消化處理后的不同組細胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，進行細胞計數(shù)，稀釋細胞并調整其含量。吸200 μl細胞懸液（約2萬個細胞），加入Transwell小室上層，在小室下方培養(yǎng)孔內加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，靜置于CO2細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。去除培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛固定小室15 min，繼而用龍膽紫染色液染色20 min，用ddH2O沖洗凈后自然晾干。將小室內側面擦凈后將其置于光學顯微鏡下進行觀察，每組選取5個視野來計細胞數(shù)目并取平均值。重復3次后選取平均值。

1.5 細胞遷移能力檢測

吸200 μl不同組細胞懸液（約2萬個細胞），加入已激活的Transwell小室上層，在小室下方培養(yǎng)孔內加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，靜置于CO2細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。去除培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛固定小室15 min，繼而用龍膽紫染色液染色20 min，用ddH2O沖洗凈后自然晾干。將小室內側面擦凈后將其置于光學顯微鏡下進行觀察，每組選取5個視野來計細胞數(shù)目并取平均值。重復3次后選取平均值。

1.6 細胞劃痕實驗

將預處理后的細胞置于6孔板中培養(yǎng)。當細胞生長至95%融合度時，使用10 μl移液管進行劃痕實驗。同時更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。應用絲裂霉素（1 μg/ml）抑制癌細胞增殖。采用倒置顯微鏡在0～24 h不同時間點記錄劃痕距離的變化。

1.7 蛋白印跡實驗

將處理后的細胞在冰上用NP40裂解液裂解15 min，然后在4℃低溫離心機12 000 r/min離心10 min，收集上清液并測蛋白濃度。用預制備的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Tris-HCL-SDSPAGE）電泳分離蛋白，然后轉移到PVDF膜上。將膜與一抗（稀釋1:1000）在4℃孵育過夜，用TBST洗滌后用二抗常溫孵育膜1 h。采用化學發(fā)光法檢測蛋白表達水平。

1.8 蛋白質免疫共沉淀

將相應抗體用蛋白L磁珠（貨號：HY-K0205,MCE）處理2 h，HEK293T細胞裂解液與預處理磁珠在4℃孵育過夜。獲取磁珠后進行蛋白印跡分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件和GraphPad Prism9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SHMT2在乳腺癌組織的表達及其與預后的關系

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌的癌組織中SHMT2表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.001），見圖1A，進而通過相關預后分析發(fā)現(xiàn)，SHMT2高表達組的5年疾病特異性生存率和總生存率均顯著低于SHMT2低表達組（均P＜0.001），見圖1B、1C。這就說明SHMT2表達與浸潤性乳腺癌的不良預后密切相關，提示可能起到癌基因作用。

圖1 SHMT2在乳腺癌中的表達(A)及其與預后的相關性(B, C)Figure 1 Expression level of SHMT2 in breast cancer(A) and its correlation with prognosis(B, C)

2.2 敲低SHMT2可降低MCF7細胞的侵襲能力

在MCF7細胞中轉染shNC對照質?；騭hSHMT2低表達質粒，用Transwell小室法檢測發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可顯著降低MCF7細胞的侵襲能力（t=5.375,P=0.0058），見圖2。

圖2 敲低SHMT2對MCF7細胞侵襲能力的影響Figure 2 Effect of SHMT2 knockdown on invasion ability of MCF7 cells

2.3 敲低SHMT2可降低MCF7細胞的遷移能力

在MCF7細胞中轉染shNC對照質?；騭hSHMT2低表達質粒，用Transwell小室法進行檢測，發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可顯著降低MCF7細胞的遷移能力（t=6.274,P=0.0033），見圖3。

圖3 敲低SHMT2對MCF7細胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of SHMT2 knockdown on migration ability of MCF7 cells

2.4 SHMT2結合并上調HAX1蛋白

為了進一步明確SHMT2調控乳腺癌細胞侵襲和遷移變化的分子機制，本研究發(fā)現(xiàn)在蛋白免疫共沉淀中用SHMT2作為誘餌蛋白，SHMT2能夠與HAX1相互結合，見圖4A。進一步在MCF7細胞中轉染shNC對照質粒、shSHMT2#1或shSHMT2#2低表達質粒，通過蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)，敲低SHMT2可降低HAX1的蛋白水平，見圖4B。這些結果說明，SHMT2能夠結合HAX1蛋白并上調其蛋白水平。

圖4 SHMT2蛋白結合(A)并下調(B)HAX1蛋白Figure 4 SHMT2 protein bound to(A) and down-regulated(B) HAX1 protein

2.5 SHMT2對MCF7細胞遷移能力的調控

為了進一步驗證SHMT2調控乳腺癌細胞侵襲轉移能力是否依賴于HAX1通路，本研究設計了相關逆轉實驗。將MCF7細胞分為三組，即shNC對照組、shSHMT2敲低組、shSHMT2+HA-HAX1回復組，轉染相應質粒后通過Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)，敲低SHMT2對MCF7細胞遷移能力的抑制作用可被高表達HAX1逆轉（t=6.274,P=0.0033;t=8.041,P=0.0013），見圖5A。繼而用細胞劃痕實驗可以得到類似結果（t=6.943,P=0.0023;t=5.654,P=0.0048），見圖5B。這就意味著，SHMT2對MCF7細胞遷移能力的促進作用是依賴于HAX1蛋白的。

2.6 SHMT2抑制劑（SHIN1）對MCF7細胞遷移能力的作用

SHIN1是SHMT1/2特異性抑制劑，可抑制SHMT2相關功能。本研究為了在細胞水平驗證SHIN1是否能抑制乳腺癌細胞轉移能力，將MCF7細胞分為三組，即Vector空載對照組、Flag-SHMT2高表達組、Flag-SHMT2+SHIN1抑制劑組，對不同組進行處理后通過Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)，SHMT2高表達可明顯增加MCF7細胞遷移能力，而加入SHMT2抑制劑（SHIN1, 10 nmol/L）后可顯著抑制細胞遷移能力（t=10.16,P=0.0005；t=8.741,P=0.0009），見圖6A。繼而用細胞劃痕實驗可以得到類似結果（t=4.416,P=0.0115;t=6.091,P=0.0037），見圖6B。

3 討論

越來越多的研究表明，SHMT2蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[11]。Li等研究表明，在MDA-MB-231細胞系中，某些細胞亞群中與SHMT2相關的一碳代謝活性升高，其轉移潛能也顯著增加。敲低SHMT2表達可有效抑制體外轉移性亞克隆的增殖水平。此外，在動物模型中進一步驗證了抑制SHMT2引起的代謝重編程會降低癌細胞增殖能力[12]。一項研究表明，在128例乳腺癌病例中檢測發(fā)現(xiàn)，SHMT2蛋白表達與腫瘤的侵襲性（TNM分期和Elson分級）呈劑量依賴性相關。分層分析結果表明，SHMT2有助于預測患者的預后，尤其是在雌激素受體（ER）陰性的乳腺癌患者中[13]。本研究中，我們通過數(shù)據(jù)分析驗證了SHMT2在乳腺癌癌組織中蛋白表達顯著高于相應的癌旁組織，而且SHMT2高表達與乳腺癌的不良預后密切相關。從而在組織及臨床水平驗證了SHMT2與乳腺癌的相關性，可能在疾病發(fā)生發(fā)展過程中起致癌作用。

最近有研究發(fā)現(xiàn)SHMT2過表達與乳腺癌的臨床治療耐藥相關。在拉帕替尼治療過程中，SHMT2升高的細胞可以減輕活性氧(ROS)的毒性作用，更容易在治療中存活下來[14]。此外，通過上調抗氧化酶HMOX1、SHMT2和SLC7A11的表達，乳腺癌細胞通過EIF2AK3/EIF2AK4-pEIF2S1-ATF4軸表現(xiàn)出對紫杉醇的耐藥性[15]。總之，這些結果表明SHMT2可能是一個有價值的乳腺癌預后生物標志物。

本研究中，我們進一步通過相關細胞水平實驗發(fā)現(xiàn)SHMT2在乳腺癌MCF7細胞系中可促進腫瘤細胞侵襲遷移。為了研究其具體分子機制，本實驗通過蛋白免疫共沉淀實驗探索SHMT2可能的下游作用靶點。HS-1-相關蛋白X-1（HAX1）是最初被鑒定為一個35 kDa的蛋白，與Src激酶底物HS-1相互作用，并被認為參與B細胞信號轉導[16]。HAX-1參與抑制細胞凋亡和促進細胞遷移，這是腫瘤發(fā)生和轉移的關鍵過程，提示在腫瘤中可能發(fā)生HAX-1過表達，從而促進細胞存活和增強惡性細胞的侵襲能力[17-18]。我們通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)SHMT2和HAX1可以相互結合，而且通過轉染shSHMT2低表達質粒發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可降低HAX1蛋白表達水平。在MCF7細胞系中敲低SHMT2同時高表達HAX1，發(fā)現(xiàn)高表達HAX1可逆轉敲低SHMT2對腫瘤細胞遷移能力的促進作用。進而驗證了SHMT2可通過結合并上調HAX1表達促進乳腺癌細胞侵襲遷移。在Transwell小室實驗中我們進一步驗證了SHMT2抑制劑可顯著降低MCF7乳腺癌細胞的遷移能力。

本研究通過生物信息學分析和細胞實驗發(fā)現(xiàn)SHMT2是乳腺癌細胞侵襲轉移的關鍵因子，并發(fā)現(xiàn)了SHMT2-HAX1信號軸在相關調控中的關鍵作用，通過細胞實驗探究了SHMT2抑制劑對乳腺癌轉移的治療潛力，為乳腺癌轉移的相關分子調控提供了新的線索和思路，為其臨床治療提供了潛在的干預靶點。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。