賀楊，陳文俊，陳潔瓊，曾文文，張雪晶，楊婷，翟東東， ，劉紅艷， ，熊飛， ，王瑩，

（1. 江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，武漢 430056；2. 江漢大學(xué)持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室，武漢 430056）

三峽工程是世界上最大的水利工程之一，1997 年實現(xiàn)長江截流，經(jīng)過多次蓄水，庫區(qū)水位由135 m 上升到175 m（楊志等，2015）。三峽大壩的建設(shè)使位于重慶市東部和湖北省宜昌市西部之間形成了長約600 km、面積約1 084 km2的峽谷河道型水庫。已有研究成果表明，三峽水庫蓄水后，庫區(qū)水生生境由原來單一的河流生境轉(zhuǎn)變?yōu)殪o水-緩水-流水梯次排列的復(fù)雜生境，使庫區(qū)魚類物種數(shù)急劇減少，魚類群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著變化（Yanget al.，2012；鄒家祥，翟紅娟，2016；Gaoet al.，2019；魏念等，2021）。20 世紀(jì)80 年代前，三峽庫區(qū)江段有140～200 種 魚 類（Fanet al.，2006）；吳 強(qiáng) 等（2006）在三峽庫區(qū)長江干流及主要支流共監(jiān)測到魚類108 種。董純等（2019）在三峽庫區(qū)干流魚類資源現(xiàn)狀與物種多樣性保護(hù)的調(diào)查中獲得84種魚類。因此，全面了解三峽庫區(qū)現(xiàn)有魚類組成和評估魚類的遺傳多樣性并提出保護(hù)措施非常必要。

自2006 年建立魚類條形碼數(shù)據(jù)庫Fish-BOL（http：//www.fishbol.org）以來，魚類DNA 條形碼數(shù)據(jù)量呈指數(shù)級上升（Ward，2012）。不少研究顯示DNA 條形碼技術(shù)能很好地進(jìn)行魚類物種鑒定：Khedkar 等（2014）基于印度納爾默達(dá)河流域314 條魚類的COⅠ條形碼，發(fā)現(xiàn)5 個隱存種和43 種該地區(qū)未報道魚類；Chen等（2015）研究了怒江1 139個樣品的COⅠ條形碼，建立了怒江魚類DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，驗證了COⅠ條形碼在魚類鑒別上的可行性；Wang 等（2021）探討了DNA 條形碼技術(shù)在向家壩庫區(qū)魚類鑒定中的應(yīng)用；郜星晨和姜偉（2021）初次構(gòu)建了三峽庫區(qū)常見小型魚類DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，但其研究的物種數(shù)目較少。

本研究一方面利用DNA 條形碼技術(shù)對三峽庫區(qū)漁獲物進(jìn)行鑒定，探討DNA 條形碼在三峽庫區(qū)魚類輔助鑒定中的適用性，構(gòu)建三峽庫區(qū)魚類DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，另一方面對一些魚類進(jìn)行了初步的遺傳多樣性分析，以期為三峽庫區(qū)魚類資源監(jiān)控、保護(hù)和管理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與形態(tài)學(xué)鑒定

2019 年8—11 月和2020 年5—8 月，在三峽庫區(qū)及各支流（太平溪、香溪河、小江、云陽、萬州、豐都、涪陵、巴南、箭灘河、涪江、嘉陵江）設(shè)置11個采樣點（圖1），漁具選擇地籠（網(wǎng)目1.2 cm）和單層多網(wǎng)目復(fù)合刺網(wǎng)等。在各采樣點進(jìn)行捕撈、現(xiàn)場鑒定、記錄魚類體長及體重等生物學(xué)性狀。參考《中國鯉科魚類志》（伍獻(xiàn)文等，1982）、《四川魚類志》（丁瑞華，1994）和《Fishes of the World》（Nelsonet al.，2016）等對物種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

圖1 三峽庫區(qū)魚類采樣點Fig. 1 Fish sampling sites in the Three Gorges Reservoir Area

共采集魚類標(biāo)本18 466 尾，為獲取各物種不同地理種群的樣本，選取其中946 尾PCR 擴(kuò)增，每個樣本取適量鰭條和肌肉保存于95%乙醇中用于COⅠ條形碼分析，隨后所有樣品用10%甲醛溶液浸泡成標(biāo)本，保存于江漢大學(xué)動物遺傳學(xué)實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

取約100 mg 魚類肌肉組織或鰭條，采用高鹽法提取基因組DNA，COⅠ基因序列擴(kuò)增引物序列為：F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’和R1：5’-TAGACTTCTGGGTGGGCCAAAGAATC-3’（Wardet al.，2005）。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taq Master Mix（含Taq-DNA-Polymerase、PCR-Buffer 和dNTP，上海捷瑞）10.3 μL，正、反向引物（10 mmol·L-1）各1.5 μL，DNA 模板1.5 μL，雙蒸水15.2 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，31 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；16 ℃ 20 min 或者結(jié)束后4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成純化回收和序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過DNAStar 中的SeqMan 對測序峰圖進(jìn)行校對和拼接（Swindell & Plasterer，1997），獲得有效的樣本序列；利用MEGA 7.0 進(jìn)行多序列比對和截取同源序列（Kumaret al.，2016），分析序列變異位點、信息位點、堿基組成情況，基于K2P 雙參數(shù)模型計算遺傳距離，可靠性經(jīng)過1 000 次自舉檢驗；通過MEGA 7.0 計算分類學(xué)分辨率（種間平均遺傳距離/種內(nèi)平均遺傳距離）；利用DNASP 5.0 計算物種單倍型數(shù)目（Librado & Rozas，2009）；通過MrBayes 3.2.3 構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹（Ronquistet al.，2012），利用Tracer 1.6 檢查貝葉斯推測的飽和度（Suchardet al.，2018）；通過DNASP 5.0 計算采 樣點≥2，且樣本量≥30 魚類樣本的單倍型數(shù)目（Nh）、單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）。參考NCBI 和BOLD 數(shù)據(jù)庫檢索所有形態(tài)物種的COⅠ基因序列，將物種序列相似度≥97%的標(biāo)本定義為同一物種（Wong & Hanner，2008），最后將測序序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 物種形態(tài)鑒定結(jié)果

946 尾標(biāo)本經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定隸屬于6 目14 科55 屬71 種（附錄Ⅰ），鯉形目Cypriniformes 鯉科Cyprinidae 物種最多（39 種，55%），其次是鲿科Bagridae（8種，11%）。

2.2 DNA條形碼序列分析

PCR 擴(kuò)增獲得946 條COⅠ基因序列，共計303個單倍型，去除兩端不可靠的堿基后得到長度為639 bp 的COⅠ基因序列矩陣，將上述序列儲存在GenBank 數(shù)據(jù)庫（附錄Ⅰ）。NCBI 和BOLD 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，926 尾有98.12%以上的相似性，屬于66個物種；20 尾的相似性為91.34%～95.74%，鑒定到屬水平，定義為5 個未命名物種，DNA 條形碼鑒定率為93%。MEGA 7.0 分析表明，946 條COⅠ基因序列中包含變異位點287 個，簡約信息位點273 個，平均堿基組成T（28.7%）、C（27.8%）、A（25.3%）、G（18.2%），呈A+T偏倚性。

在K2P 模型下，種內(nèi)遺傳距離為0～3.39%，平均為0.36%，銀飄魚Pseudolaubuca sinensis的最大，為3.39%（圖2）；屬內(nèi)種間遺傳距離為2.41%～14.83%，平均為6.88%，洞庭小鰾Microphysogobio tungtingensis與樂山小鰾Microphysogobio kiatingensis之間的遺傳距離最小，為2.41%，光唇蛇Saurogobio gymnocheilus與 蛇Saurogobio dabryi的最大，為14.83%；屬間遺傳距離為6.25%～24.49%，平均為15.57%；科間遺傳距離為13.70%～26.68%，平均為19.97%。種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的19.11倍（表1）。

表1 三峽庫區(qū)捕獲的71個物種在不同分類階元間基于K2P的遺傳距離Table 1 Genetic distance of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area within various taxonomic levels based on K2P

圖2 三峽庫區(qū)捕獲的71個物種的DNA條形碼間隙Fig. 2 DNA barcoding gaps of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area

2.3 系統(tǒng)發(fā)育與遺傳多樣性分析

基于GTR+I+G 模型構(gòu)建的303條COⅠ單倍型序列的貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖3），303 條COⅠ單倍型序列形成了71 個分支，同種序列都形成了具有較高支持率的單分支（后驗概率=1.00）。在屬水平上，除黃顙魚屬Tachysurus未聚為一支外，其余54 屬在屬水平上均各自聚為一支，支持率均為1.0。黃顙魚屬、屬Leiocassis和擬鲿屬Pseudobagrus聚為一支；在科水平上，鯉科的高體鳑鲏Rhodeus ocellatus、鳑鲏屬未命名種Rhodeussp.和大鰭Acheilognathus macropterus未聚在鯉科大支中；在目水平上，鱸形目Perciformes 未聚成單系。結(jié)果顯示，COⅠ基因序列適用于物種水平上的分類，不適用于屬及更高水平的分類。

選取三峽庫區(qū)優(yōu)勢物種鰱Hypophthalmichthys molitrix、蛇、貝氏Hemiculter bleekeri、光澤黃顙魚Tachysurus nitidus、瓦氏黃顙魚Tachysurus vachellii和短頜鱭Coilia brachygnathus進(jìn)行遺傳多樣性分析（表2）。6 種魚類480 尾標(biāo)本中共有120 個單倍型，單個物種的單倍型數(shù)目為2～16個。6種魚類在不同采樣地均存在共享單倍型，其中，短頜鱭的單倍型均為共享單倍型。遺傳多樣性分析顯示，瓦氏黃顙魚、鰱和蛇的核苷酸多樣性較高，分別為0.012 9、0.010 5 和0.008 4。貝氏、光澤黃顙魚和短頜鱭的核苷酸多樣性均小于0.002 7；最高的單倍型多樣性出現(xiàn)在巴南的蛇種群（h=0.924），最高的核苷酸多樣性出現(xiàn)在巴南的瓦氏黃顙魚種群（π=0.012 9），最低的核苷酸多樣性和單倍型多樣性均出現(xiàn)在短頜鱭萬州種群（h=0.186，π=0.000 3）。

表2 三峽庫區(qū)捕獲樣本的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity of fish species captured in the Three Gorges Reservoir Area

3 討論

3.1 DNA 條形碼在三峽庫區(qū)魚類物種鑒定中的有效性

魚類DNA 條形碼最重要的作用就是對魚類鑒定進(jìn)行分子水平上的輔助，彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，發(fā)現(xiàn)或糾正傳統(tǒng)分類學(xué)中隱含的錯誤，為有效利用魚類資源、保護(hù)魚類多樣性提供科學(xué)依據(jù)（McCuskeret al.，2013；Thomaset al.，2014；Wanget al.，2018；Shenet al.，2019）。本研究基于946 條DNA 條形碼序列，與NCBI 和BOLD 數(shù)據(jù)庫比對，鑒定出71 個物種，其中5 個為未命名種，鑒定率93%，這可能是COⅠ基因序列包含的遺傳信息有限，無法對個別物種實現(xiàn)種水平的物種鑒定或這5個未命名種的COⅠ基因序列還未被數(shù)據(jù)庫收錄。Hebert 等（2003）認(rèn)為評價DNA 條形碼可行性的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是種內(nèi)遺傳距離不得大于2%。本研究中，三峽庫區(qū)魚類種內(nèi)遺傳距離平均值為0.36%，高于北歐大陸架海洋魚類（0.21%）（Thomaset al.，2014）、印度尼西亞石斑魚科Epinephelidae物種（0.16%）（Fadliet al.，2021），但低于澳大利亞海洋魚類（0.39%）（Wardet al.，2005）、墨西哥和危地馬拉的淡水魚類（0.45%）（Valdez-Morenoet al.，2009）、北美淡水魚（0.73%）（Aprilet al.，2011）、法屬波利尼西亞、留尼汪島和馬達(dá)加斯加珊瑚礁海洋魚類（1.06%）（Hubertet al.，2012）和青藏高原高原鰍屬Triplophysa魚類（2.9%）（Liet al.，2017），這可能與魚類頻繁的基因交流和環(huán)境同質(zhì)性有關(guān)。本研究屬內(nèi)種間平均遺傳距離（6.88%）是種內(nèi)平均遺傳距離（0.36%）的19.11 倍，符合Hebert 等（2003）提出的種間平均遺傳距離必須大于種內(nèi)遺傳距離10倍以上的標(biāo)準(zhǔn)。最大種內(nèi)遺傳距離均顯著小于其最小種間遺傳距離，能形成明顯的DNA條形碼間隙；貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹中71 種魚類均形成各自的分支，且支持率較高。因此，利用線粒體COⅠ基因作為DNA 條形碼進(jìn)行三峽庫區(qū)魚類物種鑒別是可行的。

3.2 DNA條形碼在屬及屬水平以上分類不適用

在屬及屬水平以上沒有準(zhǔn)確的種群分類可能是由于線粒體COⅠ基因序列的DNA 條形碼信息位點有限，在高級階元時堿基置換趨于飽和未能解析更高分類水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，提示需要探索更多兼具保守性和差異性的DNA 序列來實現(xiàn)物種分類和鑒別（彭居俐等，2008）。

3.3 三峽庫區(qū)魚類遺傳多樣性

核苷酸多樣性指數(shù)和單倍型多樣性指數(shù)是衡量一個物種群體遺傳多樣的重要指標(biāo)（Vrijenhoek，1994）。遺傳多樣性越高，對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，其進(jìn)化潛力就越強(qiáng)（王瑾瑾等，2014）。本研究中太平溪、箭灘河和萬州的鰱種群、巴南和小江的瓦氏黃顙魚種群、巴南和香溪河的蛇種群呈高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，可能是這些物種在其采樣地?fù)碛休^穩(wěn)定且持續(xù)壯大的種群或在種群演化過程中異域分化的譜系出現(xiàn)了二次交流，積累了大量的核苷酸突變。萬州的蛇種群、巴南和萬州的光澤黃顙魚種群、巴南、太平溪和萬州的貝氏種群呈較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，可能是這些種群在歷史上經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，后來種群發(fā)生了快速擴(kuò)張。太平溪和萬州的短頜鱭種群呈較低的單倍型多樣性和核苷酸多樣性。據(jù)歷史文獻(xiàn)資料記載，短頜鱭主要分布在長江及淮河流域的中下游地區(qū)，及與長江流域相通的淡水湖泊（袁傳宓，秦安舲，1984），截至2015 年未見短頜鱭在三峽庫區(qū)分布的記錄（楊麗亞等，2022）。三峽大壩的建立使三峽庫區(qū)由急流水生境變?yōu)榫徚魉常℅aoet al.，2010），迫使喜急流魚類向上游遷移，原有魚類的繁殖和攝食也受到影響，造成庫區(qū)生態(tài)位空缺（陳轍聿等，2022），為短頜鱭提供了適宜的棲息生境，三峽庫區(qū)的短頜鱭種群可能是中下游的短頜鱭種群通過葛洲壩、三峽大壩船閘擴(kuò)散到三峽庫區(qū)形成的新種群（Yanget al.，2019；Zhaiet al.，2022）。為防止三峽庫區(qū)魚類遺傳多樣性遭到更嚴(yán)重破壞，應(yīng)對短頜鱭等外來入侵種群開展科學(xué)動態(tài)監(jiān)測和風(fēng)險評估等相關(guān)研究，以期為庫區(qū)魚類種群生物多樣性保護(hù)和資源種群的科學(xué)管理提供技術(shù)支撐。