徐西壯，夏曉華，劉瑞文

昆山市第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215300

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石（primary intrahepatic lithiasis，PIL）在我國(guó)的發(fā)病率高達(dá)1.16%[1]。西方國(guó)家90%～95%的膽結(jié)石形成于膽囊，PIL占比較少，我國(guó)約25%的結(jié)石位于肝膽管內(nèi)[2-3]。PIL主要成分為膽紅素鈣，屬于棕色色素型結(jié)石，因其疾病特點(diǎn)復(fù)雜多樣，治療困難，復(fù)發(fā)率高，部分患者常需要反復(fù)多次的手術(shù)，因而帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。PIL的形成是一個(gè)復(fù)雜且連續(xù)的過(guò)程，包括膽道的感染、慢性膽管炎、膽道狹窄、結(jié)石形成[4]。細(xì)菌在PIL的形成及復(fù)發(fā)中起著重要作用，從細(xì)菌學(xué)的角度來(lái)探討PIL形成的病因及發(fā)病機(jī)制，可豐富臨床的治療方法，對(duì)臨床的PIL防治具有指導(dǎo)意義。目前關(guān)于PIL的病因?qū)W研究較多，本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究文獻(xiàn)對(duì)PIL形成的細(xì)菌學(xué)機(jī)理進(jìn)行綜述。

1 PIL的菌群失衡

1.1 PIL的細(xì)菌種類(lèi)

過(guò)去數(shù)十年以來(lái)人們對(duì)于胃腸道內(nèi)的微生物進(jìn)行了廣泛研究，但對(duì)健康肝臟及膽管的人類(lèi)膽汁微生物群的相關(guān)研究較少。Jiménez等[5]通過(guò)對(duì)健康豬的膽道菌群進(jìn)行特征分析發(fā)現(xiàn)，健康母豬膽汁及膽道組織可檢出微生物群落，其中放線菌門(mén)（Actinobacteria）（32%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）（32%）、厚壁菌門(mén)（Phylum firmicutes）（34%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）（2%）占比較高。這一發(fā)現(xiàn)打破了人們對(duì)于膽汁內(nèi)無(wú)菌的固有認(rèn)識(shí)。目前多種微生物在PIL患者的膽汁、結(jié)石、膽道組織中均有不同程度的檢出，它們以某種機(jī)制促進(jìn)PIL的形成。有研究在PIL患者及動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中均檢測(cè)到幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的存在[6-7]，且單純或同時(shí)感染至少一種尿素酶陽(yáng)性的H.pylori，這是導(dǎo)致膽固醇性結(jié)石形成的必要條件；而且，感染細(xì)菌種類(lèi)越多，結(jié)石患病率越高。Xiao等[8]通過(guò)對(duì)40例PIL患者與10例對(duì)照者的膽汁樣本研究發(fā)現(xiàn)，PIL患者菌群多樣性較高，其中腸球菌（Enterococcus）（33.77%）與腸桿菌（Enterobacteriaceae）（12.65%）占比較多。Sheen-Chen等[9]等針對(duì)150例PIL患者的膽汁進(jìn)行化驗(yàn)，結(jié)果顯示需氧菌占比約90%，遠(yuǎn)高于厭氧菌，革蘭氏陰性菌檢出較多，為革蘭氏陽(yáng)性菌的兩倍。2022年，黃超偉等[10]通過(guò)對(duì)428例PIL患者的膽汁分析，同樣發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌較多，其中主要為大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）（32.92%）和克雷伯氏菌（Klebsiella）（15.66%），革蘭氏陽(yáng)性菌的主要為腸球菌（28.83%）。更有許多國(guó)內(nèi)外研究同樣發(fā)現(xiàn)，除上述細(xì)菌外，銅綠假單胞菌（Pseudomonas sp）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、摩根氏菌（Morganella morganii）、弗氏檸檬酸桿菌屬（Citrobacter freundii）等均有不同程度的檢出[11-14]?，F(xiàn)將國(guó)內(nèi)外報(bào)道的細(xì)菌檢出情況匯總，見(jiàn)表1。

表1 國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PIL細(xì)菌檢出情況匯總

1.2 PIL的細(xì)菌檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法多以細(xì)菌培養(yǎng)為主，該方法比較耗時(shí)且受外部環(huán)境影響較大。目前細(xì)菌檢測(cè)逐漸采用最新組學(xué)技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)的深度分析，通過(guò)提取整個(gè)細(xì)菌樣本中的DNA，以宏基因組二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）檢測(cè)微生物的遺傳物質(zhì)[15]。NGS作為一種高通量測(cè)序方法可以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)并對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行分析[16]。利用NGS技術(shù)進(jìn)行測(cè)序研究細(xì)菌菌落的結(jié)構(gòu)和組成逐步成為重要檢測(cè)方式，16S rRNA及16S rDNA基因測(cè)序即采用了此技術(shù)[17]。16S rRNA基因長(zhǎng)度相對(duì)較短（約1 542 bp），結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在大樣本量下也容易進(jìn)行測(cè)序，是目前進(jìn)行微生物鑒定的首選方法，提高了研究效率，也極大地促進(jìn)了PIL的細(xì)菌學(xué)研究[18]。

2 PIL形成的細(xì)菌學(xué)病因

2.1 細(xì)菌在膽管內(nèi)的定植與致石

E.coli等細(xì)菌之所以能在膽管內(nèi)定植，很大程度上依賴自身存在的膽汁酸（bile acids，BAs）耐受性[19-20]，這種耐受性可以保護(hù)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和DNA可以免受BAs的破壞。不同細(xì)菌在膽管內(nèi)的定植可能導(dǎo)致膽固醇的過(guò)飽和，使“膽鹽-磷脂-膽固醇”平衡被打破，促進(jìn)PIL的形成。Molinero等[21]研究發(fā)現(xiàn)，BAs的耐受性是此類(lèi)細(xì)菌生存的必備能力，這種耐受性的產(chǎn)生依賴于微生物自身的膽汁流出系統(tǒng)和膽汁酸鹽水解酶（bile-salt hydrolases，BSHs）的作用。膽汁流出系統(tǒng)通過(guò)外排泵將累積在細(xì)胞質(zhì)中的BAs和膽鹽擠壓至體外；BSHs可自由出入細(xì)胞，屬弱酸性，可以通過(guò)催化某種反應(yīng)，捕獲并運(yùn)輸質(zhì)子，調(diào)節(jié)膽汁環(huán)境的pH值，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

正常膽管內(nèi)的定植菌數(shù)量極其有限，未達(dá)到致病條件，這是由于膽汁的沖刷、肝細(xì)胞之間的緊密連接、膽鹽對(duì)細(xì)菌增殖的抑制，以及Oddi括約肌的屏障作用[22]。當(dāng)這些自身保護(hù)機(jī)制被破壞時(shí)，細(xì)菌即會(huì)通過(guò)各種途徑進(jìn)入膽道，使膽道內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生改變[23]，比如，十二指腸內(nèi)細(xì)菌經(jīng)乳頭反流至膽總管，腸道內(nèi)細(xì)菌經(jīng)門(mén)靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝內(nèi)膽管，感染的膽囊將細(xì)菌輸送至膽總管，細(xì)菌經(jīng)周?chē)馨拖到y(tǒng)侵入肝臟。這些因素進(jìn)一步導(dǎo)致膽管菌群失衡，使膽管內(nèi)細(xì)菌快速生長(zhǎng)繁殖，引起膽道急性或慢性炎癥，出現(xiàn)膽管壁變性、滲出、增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，甚至還可以引起膽管組織纖維化、膽管重塑、狹窄、變形，這些改變進(jìn)一步加重了膽汁的排泄負(fù)擔(dān)，出現(xiàn)膽汁淤積，最終導(dǎo)致PIL的形成。

2.2 β-葡萄糖醛酸酶的作用

有研究表明，膽管細(xì)菌感染在PIL形成過(guò)程中起著重要作用[24]。在膽色素性結(jié)石患者的膽汁中發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-G）、膽汁酸水解酶及磷脂酶的細(xì)菌。此類(lèi)細(xì)菌多帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的鈣離子吸附，并在膽道內(nèi)形成棕櫚酸鈣。這些細(xì)菌所產(chǎn)生的β-G等酶會(huì)改變膽汁的理化特性，進(jìn)一步促進(jìn)膽色素性結(jié)石的生成[25]。此外，低蛋白飲食可導(dǎo)致β-G的抑制劑葡聚糖-1，4內(nèi)脂水平降低，引起β-G水平變化，同樣會(huì)導(dǎo)致PIL形成。

革蘭氏陰性菌分泌的內(nèi)毒素，又稱(chēng)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），在PIL的形成及復(fù)發(fā)中起著重要作用[26]。這些細(xì)菌通過(guò)toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的作用，利用LPS誘導(dǎo)釋放多種促炎癥及纖維化因子，包括COX-2、MCP-1、IL-6、VEGF、TNF-a、TGF-β1，通過(guò)PKC/NF-κ/C-myc途徑誘導(dǎo)內(nèi)源性β-G的增加，導(dǎo)致PIL的形成及復(fù)發(fā)[27]。革蘭氏陰性菌尤其是E.coli通過(guò)分泌外源性的β-G刺激膽管分泌內(nèi)源性β-G，而β-G又可催化膽紅素鈣的形成，最終導(dǎo)致PIL[4]。有研究表明，細(xì)菌感染和膽管梗阻也是內(nèi)源性β-G活性增高的重要因素，當(dāng)感染膽汁排空時(shí)，外源性β-G迅速下降，而內(nèi)源性β-G可維持較高水平[28]。這種高水平的內(nèi)源性β-G在色素性結(jié)石的形成中起著重要作用。

2.3 腸道細(xì)菌紊亂對(duì)膽汁成分的影響

Pedersen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可能促進(jìn)厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)在腸管內(nèi)的生長(zhǎng)，然后進(jìn)一步通過(guò)某種途徑進(jìn)入膽道。針對(duì)入侵膽道的腸道細(xì)菌，膽汁具有一定的抗菌特性，這種特性主要依賴于BAs發(fā)揮作用。BAs具有兩親性，通過(guò)結(jié)合和溶解膜脂以裂解細(xì)菌[30]。BAs進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)后促進(jìn)并引發(fā)細(xì)胞毒性機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)部酸化，再由?；撬峤Y(jié)合的膽鹽裂解產(chǎn)生有毒化合物如硫化氫，進(jìn)一步造成DNA損傷。初級(jí)BAs比次級(jí)BAs毒性更大，而部分腸道細(xì)菌可以使初級(jí)BAs向次級(jí)BAs轉(zhuǎn)化，表達(dá)BSHs和膽汁酸誘導(dǎo)（bile acid-inducible，BAI）酶，可修飾并影響B(tài)As的功能及信號(hào)特性，使其免受膽汁的溶解[22]。BAs又是法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的內(nèi)源性配體，F(xiàn)XR可通過(guò)調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞因子及受體參與BAs的代謝[31]。肝內(nèi)BAs升高時(shí)，BAs可激活BAs-FXR-小異源二聚體伴侶信號(hào)通路，抑制CYP7A1及CYP7B1基因的表達(dá)，從而降低BAs在肝內(nèi)的合成。當(dāng)出現(xiàn)腸道菌群紊亂，BSH活性增強(qiáng)，促進(jìn)FXR合成，使得BAs的合成減少、膽固醇的過(guò)飽和，這一系列反應(yīng)打破了“膽鹽-磷脂-膽固醇”的平衡性，導(dǎo)致結(jié)石的形成。另有研究發(fā)現(xiàn)，由腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生的氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）是三甲胺（trimethylamine，TMA）的代謝產(chǎn)物，并經(jīng)腸上皮細(xì)胞吸收入血，隨后被黃素單加氧酶（flavin containing monooxygenases，F(xiàn)MOs）在肝臟氧化，血漿內(nèi)高水平TMAO與PIL的形成呈現(xiàn)正相關(guān)性[32]。

3 PIL的分子生物學(xué)機(jī)制

3.1 細(xì)胞因子

膽管細(xì)胞是一種上皮細(xì)胞，主要排列在肝內(nèi)和肝外的膽管樹(shù)，其主要的功能是通過(guò)多種信號(hào)通路控制膽汁的分泌。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)菌感染時(shí)，膽管細(xì)胞發(fā)生凋亡、溶解、修復(fù)和增殖等病理改變。Cheung等[33]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感染導(dǎo)致膽管壁損傷時(shí)，正常的膽管分泌功能細(xì)胞可被激活，激活后的膽管細(xì)胞可增強(qiáng)分泌炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子（包括IL-6、IL-8、TNF-α、血小板源性生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素-1、TGF-β和一氧化氮等）。這些因子而聚集免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)局部損傷，促進(jìn)膽道重塑[34]。損傷后的膽管細(xì)胞凋亡后開(kāi)始激活增殖，如果細(xì)胞持續(xù)損傷，膽管細(xì)胞便會(huì)處于永久性的細(xì)胞周期阻滯和抗凋亡狀態(tài)，最終導(dǎo)致膽管細(xì)胞組織功能障礙，進(jìn)一步促使膽管壁狹窄變性，膽汁淤積[35]。而膽汁淤積是PIL形成的重要因素[36]，過(guò)多BAs的聚集引起膽管壁損傷，再次導(dǎo)致膽管細(xì)胞大量分泌細(xì)胞因子，形成惡性循環(huán)。

3.2 基因與編碼蛋白

目前研究較多的致石基因包括CFTR、ABCB4、ABCB11等，它們均以某種機(jī)制促進(jìn)膽汁成分改變和膽道纖維化，促使PIL的形成，而細(xì)菌又在某些過(guò)程中起著重要作用。在膽管上皮細(xì)胞膜表面存在著多種特異性表達(dá)分布的轉(zhuǎn)運(yùn)體和調(diào)控蛋白，共同參與并促進(jìn)肝細(xì)胞的膽汁排泄。其中囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）蛋白的異常，可以使膽汁黏稠度增加，導(dǎo)致膽汁淤積[37]。梅璇等[38]通過(guò)對(duì)104 例PIL患者與同期120 例健康者的CFTR基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，兩組M470V位點(diǎn)上的等位基因存在差異（χ2=15.139，P＜0.01），且M470V位點(diǎn)上等位基因G頻率明顯高于對(duì)照組（60.10%vs41.67%，P＜0.01）。Reichert等[39]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)，重復(fù)回交將抗纖維化的FVB/NJ菌株的ABCB4基因片段敲除轉(zhuǎn)移到易纖維化BALB/cJ菌株，然后將這兩個(gè)同源的敲除菌株雜交，產(chǎn)生的F2后代都是ABCB4基因缺陷的；在16周齡時(shí)，F(xiàn)2小鼠均出現(xiàn)不同程度的膽道纖維化。Lammert等[40]同樣研究發(fā)現(xiàn)，敲除ABCB4基因的小鼠膽汁與膽固醇過(guò)飽和，最終導(dǎo)致PIL的形成。Gan等[41]通過(guò)外顯子測(cè)序方法對(duì)443例PIL患者和560例健康對(duì)照者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ABCB11基因突變，可通過(guò)外顯子跳躍改變基因剪接，從而影響成熟mRNA表達(dá)；而且，突變體中BSEP蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，導(dǎo)致BSEP膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)減少，進(jìn)而影響膽汁成分，導(dǎo)致PIL。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，PIL的形成是一個(gè)復(fù)雜且連續(xù)的過(guò)程，不同菌群通過(guò)影響某一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)，參與PIL的形成。PIL的形成一般伴有膽汁成分改變和膽管的慢性纖維化改變，這使PIL的治療難度進(jìn)一步增大。通過(guò)研究PIL形成的相關(guān)細(xì)菌學(xué)原理，有助于指導(dǎo)臨床上PIL的預(yù)防及治療。目前來(lái)看PIL的治療不單是去除結(jié)石，外科手術(shù)后防治感染并且維持膽管、腸道內(nèi)菌群的穩(wěn)定也是至關(guān)重要。此外，關(guān)于國(guó)內(nèi)外PIL的細(xì)菌學(xué)病因的研究成果較多，但具體機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)，利用這些成果在臨床上對(duì)應(yīng)的治療方法尚處于探索階段，還需進(jìn)行更高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照研究，為PIL的防治提供新的理論依據(jù)。