陳群 李霖 李秀娟 何德劍 王逸君

(郴州市第一人民醫(yī)院,湖南 郴州 423000)

膿毒癥是感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征〔1〕。膿毒癥從本質(zhì)上是對(duì)感染性因素的反應(yīng),其可由任何部位的感染引起,臨床上常見于肺炎、膿腫、泌尿系統(tǒng)感染等〔2〕。膿毒癥患者一般會(huì)出現(xiàn)心肌功能障礙,心肌功能障礙是相關(guān)的膿毒癥患者死亡率增加的主要因素,其中心血管系統(tǒng)介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展〔3〕。目前研究認(rèn)為,膿毒癥心肌損傷的主要機(jī)制有內(nèi)毒素炎癥因子誘導(dǎo)、線粒體功能抑制、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙和細(xì)胞凋亡等〔4〕,其中線粒體功能抑制和氧化應(yīng)激損傷的作用在臨床上備受關(guān)注。解耦連蛋白(UCP)2是線粒體陰離子通道家族的一員,在心、肺和腦等組織中廣泛分布,介導(dǎo)多種病理生理過程〔5〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展和UCP2有密切聯(lián)系,且其介導(dǎo)多種病理生理過程,例如免疫應(yīng)答反應(yīng)、食物的攝入和多種代謝性疾病〔6〕。體外研究顯示,UCP2上調(diào)可以通過調(diào)控膜電位進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元,而UCP2基因敲除則會(huì)導(dǎo)致線粒體活性氧產(chǎn)生明顯增多以致?lián)p害神經(jīng)元〔7〕。對(duì)于心肌細(xì)胞,尤其在膿毒癥狀態(tài)下的心肌細(xì)胞中UCP2的作用近年來報(bào)道較少。鏈RNA依賴的蛋白激酶(PKR)是蛋白激酶的一種,在免疫應(yīng)答、心肌細(xì)胞等方面具有明顯作用〔8〕。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-11早期以單體形式存在,活化條件下形成二聚體和剪切體。一旦Caspase-11被剪切,其就成為對(duì)病原體刺激產(chǎn)生固有免疫的重要媒介〔9〕。有研究表明,Caspase-11的激活能夠?qū)е乱环N特殊的細(xì)胞死亡方式,被成為細(xì)胞焦亡,細(xì)胞焦亡在膿毒癥的過度免疫中扮演十分重要的角色〔10〕。目前還沒有研究證實(shí)PKR和Caspase-11在膿毒癥的表達(dá)情況,因此本研究對(duì)膿毒癥腹腔感染大鼠模型給予UCP2干預(yù),觀察期對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及PKR/Caspase-11蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只SD大鼠均從遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)買〔許可證號(hào):SCXK(遼)2010-0001〕。清潔級(jí),雌、雄各半,體質(zhì)量180～200 g。適宜溫、濕度(24 ℃,自由飲水?dāng)z食)的環(huán)境中對(duì)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2試劑和儀器 UCP2膜擬物(mimics)慢病毒載體、UCP2腺相關(guān)病毒AAV-UCP2(漢恒公司);PKR抗體、Caspase-11抗體(美國(guó)Abcam公司);水合氯醛(上海國(guó)藥集團(tuán));組織強(qiáng)效裂解液RIPA(美國(guó)Solarbio公司);小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);離心機(jī)(凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);熒光顯微鏡(上海通灝光電科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 按照數(shù)字隨機(jī)法將大鼠分為假手術(shù)(Sham)組、盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)致膿毒癥模型(CLP)組、單純腺相關(guān)病毒(AAV)組、UCP2過表達(dá)手術(shù)(UCP2)組各20只。Sham組行等量生理鹽水替代病毒轉(zhuǎn)染手術(shù),3 w后模擬CLP,但開腹后不進(jìn)行盲腸結(jié)扎及穿孔,手術(shù)結(jié)束后還納盲腸至原位,關(guān)腹;CLP組行等量生理鹽水替代病毒轉(zhuǎn)染手術(shù),3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型;AAV組行單純AAV病毒心肌轉(zhuǎn)染,無目的基因的表達(dá),3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型;UCP2組行AAV-UCP2病毒心肌轉(zhuǎn)染,3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型。

1.4心肌轉(zhuǎn)染模型建立 各組大鼠進(jìn)行心肌病毒轉(zhuǎn)染。麻醉大鼠后固定,暴露胸部,氣管插管,鏈接小動(dòng)物呼吸機(jī)。以心尖部為中心,做一斜行切口,依次鈍性分離肌肉,于第4、5肋間放置小動(dòng)物開胸器暴露心臟后立即注射AAV-UCP2病毒(滴度為1×1012μg/ml)10 μl,注射6點(diǎn),共60 μl。撤出開胸器后,加大通氣量,充分膨脹肺,將胸腔積血積氣排空后縫合。觀察呼吸、心跳,穩(wěn)定后拔管肌肉注射100 kU青霉素,連續(xù)3 d,預(yù)防感染。3 w后冰凍切片心肌組織,熒光顯微鏡下觀察,并用Western印跡驗(yàn)證UCP2的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.5膿毒癥模型制備 采用CLP制備膿毒癥模型〔11〕。麻醉大鼠,仰臥位固定消毒手術(shù)部位,沿腹部正中線做一個(gè)長(zhǎng)約1.5 cm的切口,剪開皮膚和肌層,探查腹腔并找到盲腸,避免損傷腸系膜血管。把盲腸末端1/3處進(jìn)行結(jié)扎,用穿刺針穿刺兩次形成2個(gè)盲腸漏,輕輕擠出少許糞便。將盲腸還納腹腔,逐層縫合腹壁切口。Sham組不進(jìn)行盲腸結(jié)扎,其他步驟同其他3組。術(shù)后大鼠均皮下注射2～3 ml/kg的生理鹽水,分籠飼養(yǎng)。膿毒癥成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠活動(dòng)減少,蜷縮,嗜睡,立毛,口鼻、眼角分泌物增多。

1.6標(biāo)本采集 術(shù)后24 h麻醉大鼠,開胸,取心臟血5 ml置于離心管中,室溫靜置3～4 h后見血凝塊析出,離心,獲得所需血清,放置于-20 ℃冰箱中待用。血標(biāo)本獲取完畢后立即取出心臟,4 ℃鹽酸緩沖液漂洗,取左心室置于-80 ℃冰箱備用。

1.7Western印跡檢測(cè)心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達(dá) 取心肌組織置于冰上,剪碎組織,加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIPA進(jìn)行勻漿。離心10 min后取上清,在蛋白樣品中加入緩沖液混勻,煮沸后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉,封閉后分別孵育兔抗UCP2、PKR和Caspase-11多克隆抗體和小鼠抗β-actin抗體,4 ℃搖床孵育過夜;洗滌緩沖液(TBST)室溫洗滌3次后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和山羊抗小鼠IgG抗體,室溫1 h,經(jīng)TBST洗滌、滴加化學(xué)發(fā)光試劑于曝光儀中拍攝蛋白顯影條帶,ImageJ軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠心肌組織,甲醛固定后脫水,石蠟包埋組織后切片,厚度為5 μm,每組3張,切片行蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.9TUNEL法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡率 心肌組織與蛋白酶K室溫孵育,將切片組織在TUNEL反應(yīng)液中浸泡,后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。過氧化氫沖洗淬滅酶活性,后聯(lián)合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯胺覆蓋,光學(xué)高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色,每張切片隨機(jī)取5個(gè)清晰視野觀察。

1.10心肌組織丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 取10%左心室勻漿上清液,依次加入試劑盒中的試劑,充分混勻后,煮沸,10 min后離心取上清液,蒸餾水調(diào)零,于532 nm處測(cè)光密度(OD)值,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織的蛋白含量,計(jì)算各組大鼠MDA含量。取各組大鼠左心室,將組織制成勻漿后離心,收集上清液。于440 nm下測(cè)定各組吸光度值。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織的蛋白含量,計(jì)算各組大鼠SOD活性。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CLP模型建立及評(píng)價(jià) 模型制備1 d后,與Sham組相比,CLP組、AAV組及UCP2組大鼠均出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、活動(dòng)明顯減少、蜷縮、立毛眼鼻口分泌增多,甚至出現(xiàn)膿尿、稀便及呼吸困難等癥狀。開腹后發(fā)現(xiàn),盲腸呈紫黑色、腫脹、脆性增加,周圍腸腔有膿性滲出、惡臭,腸管與腹腔發(fā)生粘連。

2.2病毒轉(zhuǎn)染鑒定 注射病毒3 w后,冰凍切片,熒光顯微鏡下可見UCP2組心肌組織中UCP2病毒成功轉(zhuǎn)染,見圖1。

綠色熒光為UCP2病毒轉(zhuǎn)染成功

2.3各組UCP2蛋白表達(dá)比較 和Sham組相比,CLP組、AAV組和UCP2組心肌組織中UCP2表達(dá)明顯升高(P<0.05),且UCP2組中UCP2蛋白表達(dá)顯著高于CLP組和AAV組(P<0.05);AAV組和CLP組心肌組織中UCP2蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05),見圖2、表1。

表1 各組心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達(dá)比較

圖2 各組心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達(dá)比較

2.4各組心肌組織中PKR、Caspase-11蛋白表達(dá)比較 CLP組和AAV組心肌細(xì)胞中PKR和Caspase-11蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05);CLP組、AAV組、UCP2組心肌組織中PKR蛋白表達(dá)較Sham組明顯減少,Caspase-11蛋白表達(dá)較Sham組明顯增加(P<0.05);與CLP和AAV組相比,UCP2組心肌組織中PKR蛋白表達(dá)得到明顯回升,Caspase-11蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖2、表1。

2.5各組心肌組織病理學(xué)變化比較 與Sham組相比,CLP組心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫、間質(zhì)充血、心肌纖維變性,橫紋模糊不清甚至消失,出現(xiàn)廣泛的肌纖維波浪狀排列;AAV組和CLP組心肌組織病理變化沒有顯著差異,基本一致;與CLP組相比,UCP2組心肌細(xì)胞有少量水腫,心肌纖維排列基本正常,病變程度得到看明顯的改善,見圖3。

圖3 各組心肌組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.6各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 Sham組心肌僅有少數(shù)視野偶見個(gè)別凋亡細(xì)胞,CLP組和AAV組、UCP2組細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.05);CLP組和AAV組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與CLP組和AAV組相比,UCP2組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05),見圖4,表2。

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及MDA含量和SOD活性比較

圖4 各組心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.7各組MDA含量和SOD活性比較 CLP組和AAV組MDA含量和SOD活性沒有顯著差異(P>0.05);CLP組、AAV組、UCP2組MDA含量較Sham組顯著升高,SOD活性較Sham組明顯降低(P<0.05);UCP2組MDA含量較CLP組和AAV組得到明顯抑制,SOD活性較CLP組得到顯著升高(P<0.05),見表2。

3 討 論

目前對(duì)于膿毒癥動(dòng)物的造模主要集中在嚙齒動(dòng)物,大致可分為外源性注射型:經(jīng)靜脈、呼吸道或者腹腔直接注射活的細(xì)菌或者內(nèi)毒素脂多糖(LPS),導(dǎo)致大鼠膿毒血癥轉(zhuǎn)化為膿毒癥模型及腹膜炎型膿毒癥。破壞、先誘發(fā)肺炎后進(jìn)一步發(fā)展動(dòng)物自身屏障型:如制造燒傷型膿毒癥模型、CLP模型。研究表明,CLP制備的大鼠膿毒癥模型和臨床更接近,且易于操作,易于復(fù)制,是目前應(yīng)用最廣泛的模型〔12〕。UCP是存在于線粒體內(nèi)膜上的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體,目前已發(fā)現(xiàn)5類UCP,其中UCP2是表達(dá)最廣泛的一種,在多種組織中呈高表達(dá),如心、肺等〔13〕。UCP2在多種物質(zhì)之間有一定的同源性,與其他UCP一樣,UCP2的功能主要通過質(zhì)子漏功能驅(qū)散線粒體內(nèi)膜與基質(zhì)之間的質(zhì)子電化學(xué)梯度,使質(zhì)子回流基質(zhì)與ATP合酶發(fā)生解耦聯(lián)。在膿毒癥或炎性實(shí)驗(yàn)的模型中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心肌、肝、骨骼肌等組織中UCP2的表達(dá)明顯上調(diào)〔14〕。同時(shí)研究表明,UCP2在調(diào)控炎性反應(yīng)、限制氧化應(yīng)激及維持線粒體生理功能方面具有重要作用,介導(dǎo)膿毒癥的病理生理機(jī)制〔15〕。本研究結(jié)果和上述研究一致。

膿毒癥一旦合并心肌損傷可加重疾病的演變過程,增加多臟器衰竭及死亡的風(fēng)險(xiǎn)。近年來一些臨床研究表明,膿毒癥患者有一半以上會(huì)發(fā)展成心肌損傷,且所導(dǎo)致的心功能不全與膿毒癥致死率明顯相關(guān)。細(xì)胞凋亡也稱成為程序性的細(xì)胞死亡,心肌細(xì)胞凋亡在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮重要作用,抑制心肌細(xì)胞凋亡有助于逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷〔16〕。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)UCP2可抑制膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌組織病理學(xué)變化。研究表明,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致凋亡的機(jī)制之一。MDA是細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,當(dāng)MDA含量增高時(shí)表示體內(nèi)氧化應(yīng)激隨之增加。SOD屬于機(jī)體抗氧化酶,能保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA和SOD結(jié)合多用于評(píng)價(jià)機(jī)體的氧化應(yīng)激情況。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)UCP2能抑制膿毒癥大鼠體內(nèi)MDA含量,增加SOD活性,通過調(diào)整心肌細(xì)胞抗氧化防御及活性氧之間的平衡狀態(tài),從而抑制膿毒癥大鼠的心肌細(xì)胞凋亡。孟繁甦等〔17〕研究證實(shí),預(yù)先給予血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,這可能與血必凈注射液能夠降低心肌細(xì)胞中MDA含量,增加SOD活性,對(duì)氧化應(yīng)激損傷進(jìn)行一定的改善,同時(shí)減少心肌細(xì)胞的凋亡。

PKR是一種雙鏈RNA蛋白酶,在膿毒癥肺損傷患者中PKR出現(xiàn)低表達(dá)。黃楊等〔18〕研究證實(shí),姜黃素能夠提高膿毒癥感染急性肺損傷(ALI)大鼠免疫功能,降低炎癥表達(dá),其機(jī)制可能是用過增加PKR蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞焦亡是程序性細(xì)胞死亡方式之一,一般依賴致炎性Caspase,介導(dǎo)多種疾病,例如感染性疾病、自發(fā)性炎性疾病、自身免疫性疾病和相關(guān)癌癥等,同時(shí)伴隨炎性小體和 Caspase-11激活。研究發(fā)現(xiàn),革蘭陰性菌的LPS是激活Caspase-11的重要模式分子,在正常機(jī)體內(nèi),Caspase-11在細(xì)胞中呈低表達(dá),這說明細(xì)菌感染后,LPS 在引起Caspase-11的細(xì)胞焦亡中起到了關(guān)鍵作用〔19〕。本研究結(jié)果顯示,Caspase-11在膿毒癥大鼠中呈高表達(dá),過表達(dá)UCP2對(duì)Caspase-11的表達(dá)可進(jìn)行有效的抑制。劉雨濃等〔20〕研究證實(shí),黃連解毒湯有效組分可降低細(xì)胞內(nèi)LPS,進(jìn)而抑制Caspase-11,降低Caspase-11介導(dǎo)的Caspase-1 依賴的細(xì)胞焦亡作用。

綜上所述,過表達(dá)UCP2可抑制膿毒癥腹腔感染大鼠心肌細(xì)胞凋亡,調(diào)控體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡,同時(shí)對(duì)PKR/Caspase-11蛋白有一定的調(diào)控作用,增加PKR表達(dá),抑制Caspase-11的表達(dá)。