王芹 李立恒 王鐘華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科,河北 張家口 075000)

牙髓血運(yùn)重建術(shù)(REPs)為治療年輕恒牙根尖周病的新方法,該術(shù)可刺激根尖周損傷并誘導(dǎo)血液進(jìn)入根管,促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育〔1〕。近年來(lái),因齲齒或者外傷等原因?qū)е碌哪贻p恒牙牙髓病和根尖周病的發(fā)病率逐年上升,REPs誘導(dǎo)血管新生、促進(jìn)牙髓修復(fù)再生、治療牙髓病和根尖周病的潛在作用越來(lái)越受到臨床研究的重視〔2〕。但REPs在細(xì)胞因子水平的研究少見,其促進(jìn)牙髓血管再生修復(fù)的具體分子生物學(xué)機(jī)制也不甚明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種促血管生成最強(qiáng)烈的細(xì)胞因子,可與VEGF受體(VEGFR)2結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),參與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合及組織器官生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程〔3〕。但VEGF/VEGFR2是否參與調(diào)控牙髓血管再生促進(jìn)牙髓組織修復(fù)過(guò)程還不明確。本研究通過(guò)在根管顯微鏡下建立大鼠磨牙牙髓血管再生術(shù)動(dòng)物模型,探討VEGF/VEGFR2的動(dòng)態(tài)表達(dá)及定位情況,推測(cè)其在牙髓血管再生術(shù)后修復(fù)中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 取雄性SD大鼠25只,體質(zhì)量250～280 g,鼠齡2～3個(gè)月,口腔衛(wèi)生狀況良好,無(wú)齲齒及牙周疾病,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(渝)2017-006。飼養(yǎng)于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房?jī)?nèi)。本研究由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員審核批準(zhǔn)〔審批號(hào):IACUC-01(20160917)〕。

1.2主要試劑與儀器 胰蛋白酶〔貨號(hào):abs47047375,愛必信(上海)生物科技有限公司〕;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):R20570,廠家:上海源葉生物科技有限公司);VEGF(貨號(hào):ab69479)、VEGFR(貨號(hào):ab39638)、骨橋蛋白(OPN,貨號(hào):ab8448)、整合素(αv)β3(貨號(hào):ab119365)抗體(美國(guó)abcam公司);蛋白電泳儀(型號(hào)1658033,美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3模型構(gòu)建與分組 隨機(jī)將25只大鼠分為正常對(duì)照組、根尖周炎組、REPs術(shù)后7、14、28 d組,根尖周炎模型建立及REPs參照文獻(xiàn)〔4〕進(jìn)行。將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后,仰臥固定,用30 ml/L的飽和過(guò)氧化氫液棉球清潔口腔,750 mg/L乙醇消毒雙側(cè)磨牙區(qū),取左右兩側(cè)下頜第一磨牙放置吸唾管,全程保持無(wú)菌操作。在根管顯微鏡下用高速不銹鋼1/4球鉆從大鼠下頜第一磨牙的牙合面近中窩向下鉆磨開髓,用#6、#8K銼疏通根管,并去除根管內(nèi)牙髓,生理鹽水沖洗根管后取出K銼,建立根尖周炎模型。REPs:在第一磨牙開髓、去髓后,用生理鹽水沖洗殘留牙髓組織,再用針刺激根尖出血,棉球(無(wú)菌)輕壓止血,待凝固后將血凝塊表面用三氧化物多聚體(MTA)覆蓋,并充填流動(dòng)樹脂;術(shù)后注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保暖,待其蘇醒后,正常進(jìn)水進(jìn)食。正常對(duì)照組不做處理。正常對(duì)照組及根尖周組于術(shù)后28 d取材,REPs各組于術(shù)后7、14、28 d取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4組織標(biāo)本采集 麻醉處死大鼠,分離下頜骨,取左側(cè)下頜骨標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h。右側(cè)下頜骨標(biāo)本取牙根尖周組織,置于液氮中保存。

1.5CT影像學(xué)觀察 左側(cè)下頜骨標(biāo)本固定24 h后置于專用掃描管中,將牙體長(zhǎng)軸平行與管長(zhǎng)軸放置,調(diào)定掃描電壓為70 kV,功率30 W,電流429 μA,用顯微CT成像系統(tǒng)進(jìn)行斷層掃描15 min獲得斷面成像,用于后續(xù)觀察分析。

1.6HE染色觀察大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周組織病理學(xué)變化 左側(cè)下頜骨標(biāo)本做完CT成像后,標(biāo)本用400 g/L甲酸脫鈣處理(可針刺穿透),梯度乙醇脫水、石蠟包埋后,連續(xù)切4 μm厚切片,行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)。

1.7免疫組化染色檢測(cè)大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周組織VEGF表達(dá) 取1.6中石蠟切片,烤箱烘烤2 h,常規(guī)脫蠟、水化、3%過(guò)氧化氫滅活、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)、5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉后,加入一抗VEGF抗體(1∶500)孵育過(guò)夜,室溫下與羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染;封片后于光鏡下觀察并拍照,Image Pro Plus5.0軟件分析VEGF陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值。

1.8各組第一磨牙牙根尖周組織腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β水平檢測(cè) 取1.4中液氮中保存的部分牙根尖組織,4 ℃下解凍后加生理鹽水研磨制備組織勻漿液,離心取上清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

1.9Western印跡檢測(cè)牙根尖周組織VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達(dá) 提取牙根尖組織總蛋白,測(cè)定蛋白濃度后,電泳分離50 μg蛋白樣品并轉(zhuǎn)膜,室溫下將膜封閉2 h后,4 ℃冰箱中與一抗VEGFR2(1∶500)、OPN(1∶500)、αvβ3(1∶500)、β-肌動(dòng)蛋白(actin,1∶2 000)孵育過(guò)夜,室溫下與羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影,Image J軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般狀況 各組試驗(yàn)期間均存活,試驗(yàn)牙周及根尖周外黏膜無(wú)明顯紅腫,牙體均無(wú)折裂或充填物脫落情況。

2.2各組牙根尖及牙根尖周組織CT影像學(xué)檢查結(jié)果 正常對(duì)照組牙根發(fā)育完善,根尖孔閉合;根尖周炎組牙髓腔開放,根管壁薄,根尖孔未閉合呈開放狀;REPs術(shù)后7 d組牙髓腔較大,根管壁薄;REPs術(shù)后14 d組根管壁增粗,牙髓腔縮窄,根尖稍膨大;REPs術(shù)后28 d組,根管口閉合,管壁增厚,有新生高密度硬組織形成,見圖1。

圖1 各組牙根尖及牙根尖周組織CT影像(×100)

2.3各組牙根尖及牙根尖周組織形態(tài)變化 正常對(duì)照組根管內(nèi)可見疏松的結(jié)締組織,根尖牙周膜區(qū)為致密結(jié)締組織及大量的纖維、血管和細(xì)胞分布;根尖周炎組根管內(nèi)含壞死物質(zhì),根尖周炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,根管內(nèi)未見新生組織形成;REPs術(shù)后7 d組根管內(nèi)有少量不規(guī)則礦化基質(zhì)和致密結(jié)締組織生成,根尖區(qū)周圍聚集著少量炎癥細(xì)胞和幼稚的成纖維細(xì)胞;REPs術(shù)后14 d組根管內(nèi)有大量不規(guī)則礦化基質(zhì)和致密結(jié)締組織生成,根尖區(qū)附近細(xì)胞有進(jìn)入根管的趨勢(shì);REPs術(shù)后28 d組根管內(nèi)可見大量?jī)?nèi)含血管的新生結(jié)締組織,根管壁增厚,根尖部膨大,根尖孔縮小,見圖2。

圖2 各組牙根尖及牙周膜組織(HE染色,×200)

2.4各組根尖周組織VEGF表達(dá) 深棕色為VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。正常對(duì)照組VEGF在根尖周組織中呈弱陽(yáng)性表達(dá);根尖周炎組VEGF在根尖孔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);REPs術(shù)后7 d組VEGF在根尖周增生的成纖維細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);REPs術(shù)后14 d組及28 d組VEGF在根尖周骨組織骨細(xì)胞與吸收的陷窩內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。見圖3。與正常組對(duì)照相比,其他各組VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高;與根尖周炎組相比,REPs術(shù)后7、14、28 d組VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高;與術(shù)后7 d組相比,REPs術(shù)后14、28 d組,VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高(均P<0.05),見表1。

表1 各組牙根尖及牙根尖周組織VEGF、TNF-α、IL-1β、VEGFR2、OPN、αvβ3表達(dá)水平比較

圖3 各組根尖周組織VEGF表達(dá)(免疫組化,×400)

2.5各組根尖周組織TNF-α、IL-1β水平 與正常對(duì)照組相比,根尖周炎組TNF-α、IL-1β水平顯著升高;與根尖周炎組相比,REPs術(shù)后7、14、28 d組上述指標(biāo)水平顯著降低;與REPs術(shù)后7 d組相比,REPs術(shù)后14、28 d組上述指標(biāo)均顯著降低;與REPs術(shù)后14 d組相比,REPs術(shù)后28 d組上述指標(biāo)均顯著降低(均P<0.05),見表1。

2.6各組根尖周組織中VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達(dá)情況 與正常對(duì)照組相比,根尖周炎組根尖周組織VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高,OPN、αvβ3蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05);與根尖周炎組相比,REPs術(shù)后7、14、28 d組VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達(dá)均顯著增高;與REPs術(shù)后7 d組相比,REPs術(shù)后14、28 d組上述指標(biāo)均顯著升高(均P<0.05),見表1、圖4。

1～5:正常對(duì)照組、根尖周炎組、REPs術(shù)后7 d組、REPs術(shù)后14 d組、REPs術(shù)后28 d組

3 討 論

由于牙根發(fā)育不完全、根管壁薄、根尖孔呈敞開狀態(tài)年輕恒牙易受各種侵害,致使牙髓壞死、牙根發(fā)育受限、根尖開放、根部脆弱甚至脫落,嚴(yán)重影響患者咬合功能〔5〕。年輕恒牙的根管治療一直是牙醫(yī)工作的難題〔6〕,研究發(fā)現(xiàn),REPs術(shù)可通過(guò)刺激根尖部出血誘導(dǎo)根尖周干細(xì)胞遷移和分化,恢復(fù)牙髓活力再生及牙根生長(zhǎng)發(fā)育〔7〕。研究證實(shí)大鼠上頜第一磨牙牙根可在第15天開始發(fā)育,25～30 d發(fā)育完成〔8〕,而REPs可在28 d左右完成牙周膜的修復(fù)〔9〕。本研究隨著REPs治療時(shí)間延長(zhǎng),大鼠根管壁逐漸增粗、牙髓腔逐漸縮窄、牙根尖逐漸膨大閉合,根尖周組織炎癥細(xì)胞逐漸減少,成纖維細(xì)胞逐漸增多,根管內(nèi)礦化基質(zhì)和致密結(jié)締組織逐漸生成,至術(shù)后28 d時(shí)根管內(nèi)有新生結(jié)締組織、血管樣結(jié)構(gòu)生成,根尖區(qū)附近有骨樣細(xì)胞沉積,另外根尖周組織TNF-α、IL-1β水平逐漸降低且接近正常值,提示REPs術(shù)后大鼠牙周組織炎癥水平降低,牙根管逐漸閉合生長(zhǎng),牙髓組織逐漸修復(fù),與研究〔10〕REPs術(shù)后人類年輕恒牙放射影像學(xué)研究一致,證實(shí)REPs可用于恒牙根尖周病的治療,但其治療的分子機(jī)制還不甚明確。

血管生成是促進(jìn)傷口愈合的關(guān)鍵步驟,也是牙齒修復(fù)過(guò)程中牙髓血管生成的前提條件〔11〕。研究證實(shí),在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程,牙本質(zhì)基質(zhì)釋放VEGF,形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體,促進(jìn)牙髓再生〔12〕。牙髓修復(fù)過(guò)程中的VEGF可能來(lái)源于根尖周組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞〔13,14〕,提示VEGF可能在牙髓血管生成修復(fù)過(guò)程中起重要作用。本研究提示,REPs術(shù)促進(jìn)牙根生長(zhǎng)及牙髓再生的作用可能與促進(jìn)根尖周組織中VEGF表達(dá)有關(guān)。

VEGF主要通過(guò)受體VEGFR2進(jìn)行傳導(dǎo)并調(diào)控血管生成及細(xì)胞的增殖遷移,研究證實(shí),VEGF-VEGFR2可通過(guò)局部黏著斑激酶(FAK)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路調(diào)控人牙髓干細(xì)胞遷移,促進(jìn)炎癥牙髓組織的修復(fù)〔15〕。張映娟等〔9〕發(fā)現(xiàn),無(wú)髓年輕恒牙REPs術(shù)后在牙根管及根尖內(nèi)檢測(cè)到骨組織沉積及根尖閉合趨勢(shì),提示REPs術(shù)促進(jìn)牙根閉合及牙根生長(zhǎng)的作用,也可能與促進(jìn)牙髓干細(xì)胞骨組織沉積有關(guān)。史欣等〔16〕發(fā)現(xiàn),OPN誘導(dǎo)液可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成骨分化,證實(shí)OPN在骨礦化、代謝及重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外,OPN除是成骨分化誘導(dǎo)因子外,還是一種黏附因子〔17〕,研究證實(shí),OPN不僅可通過(guò)αvβ3受體介導(dǎo)細(xì)胞黏附,形成酸性環(huán)境,促進(jìn)細(xì)胞移行和擴(kuò)散〔18〕,還可通過(guò)VEGF促進(jìn)血管生成〔19〕。αvβ3也可介導(dǎo)破骨細(xì)胞與纖維蛋白結(jié)合,參與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、破骨細(xì)胞分化、成熟過(guò)程,促進(jìn)破骨細(xì)胞通過(guò)血管系統(tǒng)在骨組織聚集〔20〕。本研究推測(cè),根尖周組織具有成骨分化及遷移的因子作用較弱可能是恒牙牙根停止發(fā)育的關(guān)鍵因素。本研究表明REPs術(shù)可通過(guò)激活VEGF/VEGFR2通路,促進(jìn)牙根尖周組織及牙髓組織血管再生,上調(diào)OPN、αvβ3蛋白表達(dá),誘導(dǎo)成骨分化及遷移,促進(jìn)牙根生長(zhǎng)及牙髓再生。

本研究為闡明REPs促進(jìn)牙根生長(zhǎng)及牙髓再生的分子機(jī)制提供一定參考,但VEGF/VEGFR2信號(hào)通路靶分子較多,牙髓再生及牙根生長(zhǎng)的分子機(jī)制復(fù)雜多樣,REPs術(shù)后牙髓再生及牙根生長(zhǎng)的機(jī)制,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。