唐靜 陽(yáng)帆 周麗麗 袁小波

(湘潭市第一人民醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心,湖南 湘潭 411100;2營(yíng)養(yǎng)科;3湖南交通工程學(xué)院護(hù)理學(xué)院)

老年性白內(nèi)障是主要致盲性疾病之一,隨著老年人口的快速增加,白內(nèi)障患病率進(jìn)一步提升,在降低患者生存質(zhì)量的同時(shí)加重了社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)〔1〕。由于老年性白內(nèi)障的病因尚未闡明,導(dǎo)致藥物療效不佳,臨床治療仍以手術(shù)為主〔2〕。研究發(fā)現(xiàn),晶狀體蛋白質(zhì)變性會(huì)影響正常的折射功能,引發(fā)不同程度的晶狀體混濁〔3〕。泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式,其中E3連接酶與底物蛋白的特異性密切相關(guān),因此在調(diào)控泛素化過(guò)程中的作用最明顯〔4,5〕。相關(guān)研究已證實(shí),老齡大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中存在DNA損傷和DNA修復(fù)酶活性下降,提示DNA氧化損傷及修復(fù)障礙可能參與老年性白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展〔6〕。研究報(bào)道顯示,8-氧代鳥嘌呤-DNA糖基化酶(OGG)1參與晶狀體上皮細(xì)胞的DNA修復(fù)過(guò)程,在白內(nèi)障病情發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔7〕。但關(guān)于OGG1蛋白翻譯后修飾的研究仍十分少見。本研究探討熱休克蛋白70羰基末端反應(yīng)蛋白(CHIP)介導(dǎo)的OGG1在老年性白內(nèi)障發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 SRA01/04永生化人晶狀體上皮細(xì)胞株購(gòu)于上海弘順生物有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于百草泰克(北京)生物科技有限公司;手持中波紫外線檢測(cè)燈購(gòu)于蘇州圣光儀器有限公司;CHIP蛋白過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由北京博云華康基因科技有限公司設(shè)計(jì)合成;兔抗人CHIP單克隆抗體,鼠抗人OGG1單克隆抗體,鼠抗人β-actin單克隆抗體,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均購(gòu)于銘修(上海)生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及氧化損傷模型建立 將SRA01/04永生化人晶狀體上皮細(xì)胞取出,放入37 ℃恒溫水浴箱中解凍,之后2 000 r/min離心15 min,離心半徑10 cm,將上清液棄去,加入新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10 g/L青鏈霉素),接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育,每24～48 h換液,顯微鏡下觀察細(xì)胞密度超過(guò)80%時(shí),使用Hanks平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,加入磷酸緩沖液,用手持中波紫外線檢測(cè)燈在30 cm處照射。將細(xì)胞分為對(duì)照組和模型組,根據(jù)照射時(shí)間將模型組進(jìn)一步分成5個(gè)亞組(0、10、20、30、40 min),中波紫外線照射時(shí)間結(jié)束后,更換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將SRA01/04永生化人晶狀體上皮細(xì)胞接種到6孔板中,37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),顯微鏡下觀察細(xì)胞密度超過(guò)70%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為空白對(duì)照組、空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,培養(yǎng)孔中加入試劑體積為VOpti-MEM∶V脂質(zhì)體3000∶Vp3000=250 μl∶70 μl∶10 μl,之后再加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒3 μg混合均勻,室溫條件下靜置20 min。放入37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h,之后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10 g/L青鏈霉素)繼續(xù)孵育72 h。再建立細(xì)胞氧化損傷模型,設(shè)為細(xì)胞氧化損傷模型組。

1.4免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入免疫沉淀裂解液(20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,100 mmol/L氯化鈉溶液,1% Triton X-100溶液),分離蛋白質(zhì)上清液。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)分組如下:IgG組、OGG1組、CHIP組,使用OGG1抗體沉淀下與OGG1抗體結(jié)合的蛋白,使用CHIP抗體沉淀下與CHIP抗體結(jié)合的蛋白;每組取500 μg蛋白,加入1 μl相對(duì)應(yīng)的抗體后放于搖床上過(guò)夜。次日使用磁力架提取抗體蛋白復(fù)合物,進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn);同時(shí)從未經(jīng)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞總蛋白組中取40 μl蛋白原液檢測(cè)內(nèi)源性蛋白表達(dá)。

1.5Western印跡檢測(cè)OGG1、CHIP蛋白表達(dá) 將細(xì)胞放于冰上,磷酸緩沖液充分洗滌后加入RIPA細(xì)胞裂解液200 μl,冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白的上樣量,行10%十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,電泳參數(shù)為80 V、120 min;電轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,用封閉液在室溫條件下封閉2 h。按照抗體說(shuō)明書配制一抗稀釋液并滴加:兔抗人CHIP單克隆抗體(稀釋度:1∶1 000),鼠抗人OGG1單克隆抗體(稀釋度:1∶400),鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋度:1∶2 000),放入4 ℃冰箱中過(guò)夜。次日加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG,均為1∶5 000稀釋,室溫孵育2 h,洗滌后顯影,記錄各條帶的灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,多組間比較行方差分析,兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1晶狀體上皮細(xì)胞中OGG1蛋白的泛素化修飾及E3泛素連接酶的預(yù)測(cè) 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,晶狀體上皮細(xì)胞中存在OGG1蛋白的泛素化修飾;使用人類泛素連接酶與底物相互作用的預(yù)測(cè)和展示系統(tǒng)UbiBrowser分析顯示,CHIP可能是引發(fā)OGG1泛素化修飾的E3泛素連接酶。 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,CHIP能夠與OGG1相互結(jié)合,提示OGG1可能參與OGG1蛋白的泛素化修飾過(guò)程。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)CHIP與OGG1的相互作用

2.2不同中波紫外線照射時(shí)間晶狀體上皮細(xì)胞中CHIP蛋白表達(dá) 與中波紫外照射0 min(1.04±0.02)相比,10、20、30、40 min CHIP蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.06、1.37±0.10、1.85±0.08、2.64±0.15,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 min時(shí),CHIP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于其他中波紫外線照射時(shí)間,20～40 min時(shí),隨著照射時(shí)間增加,CHIP蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同中波紫外線照射時(shí)間晶狀體上皮細(xì)胞中CHIP蛋白表達(dá)

2.3CHIP蛋白過(guò)表達(dá)模型驗(yàn)證 CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組晶狀體上皮細(xì)胞中CHIP蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.48±0.03)明顯高于細(xì)胞氧化損傷模型組(0.95±0.01)和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.93±0.01)和空白對(duì)照組(0.96±0.01,P<0.05);CHIP蛋白相對(duì)表達(dá)量在空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

1～4:空白對(duì)照組、細(xì)胞氧化損傷模型組、空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;下圖同

2.4各組OGG1蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組(1.04±0.03)相比,細(xì)胞氧化損傷模型組OGG1蛋白相對(duì)表達(dá)量(4.76±0.27)明顯升高(P<0.01);CHIP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(3.58±0.24)明顯低于細(xì)胞氧化損傷模型組和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(4.92±0.30,P<0.05);細(xì)胞氧化損傷模型組與+空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OGG1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組晶狀體上皮細(xì)胞中OGG1蛋白表達(dá)

3 討 論

老年性白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展受中波紫外線照射、氧化損傷等多種因素影響〔8〕。研究顯示,中波紫外線照射是老年性白內(nèi)障發(fā)展過(guò)程中的主要環(huán)境因素〔9〕。晶狀體上皮細(xì)胞通過(guò)吸收大量中波紫外線引發(fā)一系列分子改變,包括DNA氧化損傷、細(xì)胞周期改變及泛素化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾等,破壞了晶狀體上皮細(xì)胞中功能蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊〔10〕。研究報(bào)道顯示,在神經(jīng)退行性病變等年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中,中波紫外線照射、自由基等氧化應(yīng)激狀態(tài)均會(huì)引發(fā)DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路相關(guān)因子無(wú)法被泛素化及時(shí)降解,抑制對(duì)受損DNA的修復(fù)〔11〕;同時(shí)上述因子還會(huì)引發(fā)蛋白毒性,干擾細(xì)胞的正常生理過(guò)程。泛素蛋白酶系統(tǒng)包括底物蛋白泛素化、泛素標(biāo)記蛋白降解兩個(gè)過(guò)程,是真核細(xì)胞清除錯(cuò)誤折疊蛋白的主要手段之一〔12〕。泛素蛋白酶體系統(tǒng)包括E1、E2、E3及去泛素化酶和蛋白酶,形成過(guò)程主要包括:在腺嘌呤核苷三磷酸供能的基礎(chǔ)上,E1與泛素C端的殘基特異性結(jié)合后激活泛素,之后E1轉(zhuǎn)移到E2生成中間產(chǎn)物,E2與不同類型的E3共同形成泛素化修飾〔13〕。在上述過(guò)程中,E3能夠識(shí)別底物蛋白并聚集E2,在蛋白質(zhì)泛素化修飾調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

CHIP屬于胞質(zhì)蛋白,具有E3泛素連接酶活性,可經(jīng)泛素蛋白酶途徑促使CHIP底物發(fā)生泛素化修飾,包括氨基端TRR區(qū)、羧基端U-box區(qū)、中間功能區(qū)3個(gè)功能域,維持人體正常蛋白水平,降解突變蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白,在維持細(xì)胞正常功能中發(fā)揮重要作用〔14〕。本研究說(shuō)明CHIP可能參與調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷過(guò)程。

研究發(fā)現(xiàn),CHIP通過(guò)靶向降解P21、P57等DNA損傷修復(fù)蛋白,影響細(xì)胞周期過(guò)程,抑制惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔15〕。亦有研究發(fā)現(xiàn),OGG1是DNA堿基切除修復(fù)過(guò)程中的重要調(diào)控蛋白〔16〕。本研究確定CHIP能夠與OGG1相互結(jié)合,提示OGG1可能參與OGG1蛋白的泛素化修飾過(guò)程,并提示氧化損傷早期晶狀體上皮細(xì)胞中CHIP高表達(dá),OGG1蛋白表達(dá)下調(diào),抑制損傷DNA的修復(fù),促進(jìn)老年性白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展。