畢秋左 安艷蘇

云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 曲靖 655000

中消軟膏是由大黃、關(guān)黃柏、草烏、川烏、制天南星、白芷、白及等十二味藥材經(jīng)粉碎加工制成的制劑。具有清熱解毒、散瘀消腫、勝濕止痛的功效。臨床上用于熱毒瘀滯肌膚所致瘡瘍中毒，肌膚紅、腫、熱、痛，關(guān)節(jié)重著麻木、腫痛、曲伸不利；皮膚疔瘡、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等。方中大黃具有涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效[1-3]。關(guān)黃柏為一味常用中藥，外用可治療濕熱瀉痢、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢等[4-5]。白芷具有解表散寒、祛風(fēng)止痛，消毒排膿之功效[6]。該藥由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制備，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為滇ZJGF-557-2020，此標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，未對(duì)其中任何成分進(jìn)行含量控制，查詢文獻(xiàn)也缺少對(duì)該藥的相關(guān)探索研究。故本文圍繞君藥大黃、關(guān)黃柏中蘆薈大黃素、大黃酚、鹽酸小檗堿及臣藥白芷中歐前胡素活性成分展開(kāi)研究，采用高效液相色譜法(HPLC法)同時(shí)對(duì)多成分含量測(cè)定，可為中消軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供方法參考。

1 材料

1.1 儀器 美國(guó) Agilent 1260型高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測(cè)器)；Mettle MS205DU電子天平(精度為十萬(wàn)分之一)；AS-10200B系列超聲波清洗機(jī)(60KHz/300W)。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素(中檢院，批號(hào)：110795-202011)、大黃酚(中檢院，批號(hào)：110796-201922)、鹽酸小檗堿(中檢院，批號(hào)：110713-202015)、歐前胡素(中檢院，批號(hào)：110826-201918)。中消軟膏(昆明市中醫(yī)院，批號(hào)：21112601、22042901、22022501、22112701)；甲醇、磷酸均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6-8]依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%的磷酸水溶液(B)；梯度洗脫，0～19 min，28%A；19～21 min，28%～50%A；21～29 min，50%A；29～34 min，50%～60%A；34～44 min，60%A；44～45 min，60%～28%A；45～50min，28%A。進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃。

2.2 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和供試品溶液

2.2.1 鹽酸小檗堿對(duì)照儲(chǔ)備溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品15.18 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為521.5848 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.2 大黃酚對(duì)照儲(chǔ)備溶液制備 精密稱取大黃酚對(duì)照品10.01 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為198.9988 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 蘆薈大黃素、歐前胡素混合對(duì)照儲(chǔ)備溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品15.26 mg，歐前胡素對(duì)照品12.06 mg，分別置于100 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取上述溶液2.5 mL、5.0 mL，置于同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。即得蘆薈大黃素7.4392 μg/mL，歐前胡素11.9394 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.4 4種成分混合對(duì)照溶液制備 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下儲(chǔ)備液2.0 mL，“2.2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液5.0 mL，“2.2.3”項(xiàng)下儲(chǔ)備液2.0 mL于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。即得鹽酸小檗堿104.3170 μg/mL，大黃酚99.4994 μg/mL，蘆薈大黃素1.4878 μg/mL，歐前胡素2.3879 μg/mL的混合對(duì)照溶液。

2.2.5 供試品溶液制備[9-10]精密稱取中消軟膏劑(批號(hào)為22042901)3 g至50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，超聲45 min使其溶解，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，洗滌沉淀，合并洗液至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，備用。

2.2.6 陰性對(duì)照溶液制備 按照中消軟膏處方工藝制備缺少大黃、關(guān)黃柏、白芷的陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取混合對(duì)照溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜圖。鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酚、歐前胡素各成分分離度良好，陰性對(duì)照溶液在與混合對(duì)照溶液相應(yīng)保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，說(shuō)明中消軟膏中其他成分對(duì)待測(cè)成分無(wú)干擾。如圖1所示。

(A)混合對(duì)照

2.4 線性考察 分別精密吸取2.2.4項(xiàng)下混合對(duì)照溶液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程及線性范圍。結(jié)果表明各成分對(duì)照品在如下線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系。詳見(jiàn)表1。

表1 各成分回歸方程及線性范圍表

2.5 精密度試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下中消軟膏供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酚、歐前胡素4個(gè)成分的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為0.18%、1.30%、0.45%、0.88%，可見(jiàn)儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下中消軟膏供試品溶液，分別于配制后室溫下放置0 h、1 h、3 h、9 h、12 h、15 h、18 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果中消軟膏中鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酚、歐前胡素各成分24 h峰面積RSD分別為：0.32%、0.46%、0.55%、0.83%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取中消軟膏(批號(hào)：22042901)樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取20 μL進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算得鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酚、歐前胡素各成分平均含量分別為：244.4040 μg/g、4.5296 μg/g、2.6922 μg/g、7.2705 μg/g；RSD分別為：0.69%、0.57%、1.02%、0.66%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：22042901)約1.5 g，共6份，分別于樣品中精密加入“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8 mL、0.2 mL、1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試樣測(cè)定結(jié)果表

2.8 樣品含量測(cè)定 取4批中消軟膏樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果表 (n=4)

3 討論

醫(yī)院制劑長(zhǎng)期作為一種醫(yī)院藥品的補(bǔ)充形式存在，因制劑制備方法簡(jiǎn)單方便、使用效果良好的特點(diǎn)在臨床用藥中占有一定比例。該制劑屬于軟膏劑，取樣時(shí)不易操作且易粘附在壁上，查閱軟膏劑含量測(cè)定方法文獻(xiàn)，選擇先取用離心管加甲醇適量超聲溶解，離心，取上清液至量瓶中的方法，從而解決了粘附問(wèn)題并且回收率效果良好。

3.1 提取方法及時(shí)間選擇 先后比較超聲和回流兩種提取方式提取效果的差別，發(fā)現(xiàn)兩種提取方式對(duì)選定的目標(biāo)成分的含量無(wú)明顯影響；再依次考察超聲時(shí)間30 min、45 min、60 min對(duì)提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲30 min時(shí)，大黃酚和蘆薈大黃素的提取效果不佳；而超聲45 min和60 min各主成分提取完全且效果相當(dāng)；考慮到同等效率用時(shí)最短及操作簡(jiǎn)便易行，故選擇超聲提取45 min。

3.2 流動(dòng)相選擇 預(yù)試驗(yàn)比較了以乙腈-0.1%的磷酸水溶液和以甲醇-0.1%的磷酸水溶液作為流動(dòng)相的色譜條件優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%的磷酸水溶液系統(tǒng)分離效果更佳，基線平穩(wěn)，故流動(dòng)相選擇乙腈-0.1%的磷酸。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品、對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(200～400 nm)，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃酚在245 nm處有最大吸收，鹽酸小檗堿、歐前胡素分別在345 nm、300nm處有最大吸收，且鹽酸小檗堿和歐前胡素在254 nm處也有較大吸收，結(jié)合參考文獻(xiàn)[5，8]，考慮到各成分色譜峰響應(yīng)的均勻性，故選擇254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.4 外用給藥 外用給藥是中藥的傳統(tǒng)給藥方式，中消軟膏作為一種外用中藥制劑，使用時(shí)和其他外用中藥制劑一樣具有使用便利、直達(dá)病灶等特點(diǎn)。外用藥物通常為透皮吸收，而藥物經(jīng)皮吸收率相比較于其他給藥方式較差，故準(zhǔn)確把握好各個(gè)有效成分的量及比例不容忽略[11]。試驗(yàn)中選定鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酚、歐前胡素作為指標(biāo)性成分研究，涵蓋了處方中部分君臣藥物，通過(guò)對(duì)各成分含量同時(shí)測(cè)定，有助于全面控制其質(zhì)量。