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        紫花地丁輻照前、后鎮(zhèn)痛、抗炎及抗菌活性對比研究

        2023-10-05 10:18:52顏宏柴琇瑛趙道強(qiáng)郭琰李婷鐘承志吳德松
        云南中醫(yī)中藥雜志 2023年9期
        關(guān)鍵詞:紫花地丁鎮(zhèn)痛抗炎

        顏宏 柴琇瑛 趙道強(qiáng) 郭琰 李婷 鐘承志 吳德松

        摘要:目的 對紫花地丁輻照前、后樣品的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌活性和安全性進(jìn)行對比研究。方法 采用最大給藥量法測定輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥的急性毒性;采用醋酸致小鼠疼痛模型、二甲苯致小鼠耳腫模型和最小抑菌濃度(MIC)值測定實(shí)驗(yàn),對比紫花地丁輻照前、后樣品的藥效學(xué)活性。結(jié)果 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:紫花地丁輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥最大給藥量為24 g/kg,小鼠灌胃后的毒性反應(yīng)主要為腹瀉癥狀,于給藥后第2日恢復(fù)正常,二者在安全性方面無明顯差異。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示:紫花地丁輻照前、后樣品均可顯著降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)、抑制二甲苯致小鼠耳腫,并在體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和肺炎鏈球菌均具有一定的抑制作用,且輻照前、后樣品抑制作用一致,最小抑菌濃度MIC值分別為2.5、2.5、1.25、1.25 mg/mL。從藥效活性來看,二者無明顯差異。結(jié)論 紫花地丁輻照前、后樣品在安全性和藥效學(xué)活性方面均無明顯差異,初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

        關(guān)鍵詞:紫花地丁;輻照滅菌;急性毒性試驗(yàn);安全性;抗炎;鎮(zhèn)痛;抗菌

        中圖分類號:R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1007-2349(2023)09-0001-03

        輻照滅菌技術(shù)利用電離輻射(主要指60Co-γ射線、加速器產(chǎn)生高能電子束或轉(zhuǎn)換成的X射線)與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的物理、化學(xué)和生物效應(yīng),抑制微生物遺傳物質(zhì)合成,從而達(dá)到滅菌效果[1]。它是一種新型、高效的滅菌方法,尤其是對揮發(fā)性、熱敏性中藥,表現(xiàn)出了優(yōu)越性,已成為傳統(tǒng)中藥滅菌的重要補(bǔ)充方法[2]。它的特點(diǎn)是穿透力強(qiáng),可有效避免藥品或藥材在使用之前的二次污染;可在常溫下進(jìn)行,不會明顯升高被輻照物的溫度,是熱敏藥物的最佳滅菌方法[3];同時,輻照滅菌操作簡便、速度快,輻照后可立即使用,無需靜置或冷卻,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。[KG)]

        紫花地?。╒iola yedoensis)是堇菜科多年生草本植物,性寒味苦,在民間有著悠久的用藥歷史,在中國傳統(tǒng)醫(yī)用上,紫花地丁主要以全草入藥,主要用于抗菌消炎、清熱解毒和涼血消腫,同時外用治療濕疹、瘙癢和粉刺等皮膚病?,F(xiàn)代醫(yī)用上發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗病毒、抗炎、抑菌和抗腫瘤活性,臨床上多用于治療疔瘡腫毒、尿路感染、蜂窩組織炎、乳腺炎和咽炎等,外用治療癰腫、跌打損傷和毒蛇咬傷等。由此可見,紫花地丁有著很高的開發(fā)價值[1]。為了滿足規(guī)?;a(chǎn)的需要,我們將紫花地丁的滅菌方式改為輻照滅菌,但是對于不同的藥材,其最佳的輻照劑量不同,輻照劑量過大會引起個別中藥化學(xué)成分、生物活性的變化。參照《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)規(guī)定和紫花地丁的臨床應(yīng)用[4,5],我們對紫花地丁輻照前后樣品的安全性、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌活性進(jìn)行了初步評價,為其工藝改進(jìn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 受試樣品 紫花地丁干燥全草,由云南白藥集團(tuán)中藥資源事業(yè)部提供,批號:2018120503-1。樣品制備方法:取紫花地丁干燥全草,粉碎后過150目篩,過篩率67.13%,灰綠色粉末,批號:YC2421301,為紫花地?。ㄝ椪涨埃悠?。取紫花地丁干燥全草,經(jīng)60Co輻照滅菌(輻照劑量為20 kGy),粉碎后過150目篩,過篩濾66.77%,灰綠色粉末,批號:YC2421301,為紫花地?。ㄝ椪蘸螅悠贰蓸悠肪稍颇鲜∷幬镅芯克烊凰幬锘瘜W(xué)研究室提供,常溫、密封、干燥保存。

        1.2 菌株 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213,批號:010123;大腸埃希菌Escherichia coli ATCC25922,批號:010888;白色念珠菌Candida albicans ATCC10231,批號:016783;肺炎鏈球菌Streprococcus neumonia ATCC49619,批號:010123,均購自美國特種生物貯藏中心。

        1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基配制:精確稱取酵母提取物5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,氯化鈉5.0 g,氫氧化鈉40.0 mg,溶于純水并用容量瓶定容至1 L,121 ℃高壓滅菌30 min,冷卻后備用。MUELLER-HINTON BROTH(MH)液體培養(yǎng)基配制:精確稱取21.0 gMH粉末溶于純水并用容量瓶定容至1 L,121 ℃高壓滅菌30 min,冷卻后備用。

        1.4 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級KM小鼠,體質(zhì)量18~22 g,共156只,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供;實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004。本單位實(shí)驗(yàn)動物使用許可證:SYXK(滇)K2017-0004,發(fā)證單位:昆明市科技局。實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)云南省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會(IACUC)審查同意,動物倫理編號:動(倫)IACUC-2018-023-01。

        1.5 主要儀器 JJ2000型電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn);SQP型電子分析天平,賽多利斯(北京)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀,美國Thermo公司生產(chǎn);THZ-D型臺式恒溫振蕩器,江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

        1.6 主要試劑 冰醋酸,西隴化工股份有限公司生產(chǎn),批號:1211011;二甲苯,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司生產(chǎn),批號:20140701;阿司匹林腸溶片,拜耳醫(yī)藥公司生產(chǎn),BJ24851;注射用美羅培南,住友制藥(蘇州)有限公司,批號:2160c。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 小鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn) 在開展小鼠急性毒性正式試驗(yàn)前,首先摸索紫花地丁輻照前、后樣品可配制出的,且利于動物灌胃給藥的最大濃度(濃度過高可能堵塞灌胃針)。用電子天平精確稱取紫花地丁輻照前、后樣品各10.00 g于研缽中,加入少量純水充分研磨均勻,并將研磨后的混懸液移入量筒中;再用純水多次洗凈研缽,并將混懸液移入量筒中,最終體積約為50 mL,此時兩樣品的濃度為0.2 g/mL;在正式試驗(yàn)時,小鼠以40 mL/kg給藥體積灌胃給藥,則給藥劑量為8 g/kg。

        正式試驗(yàn)時,參照文獻(xiàn)方法[6],取SPF級KM小鼠60只,隨機(jī)分為空白組、紫花地?。ㄝ椪涨埃?4 g/kg(單次最大給藥劑量為8 g/kg,給藥3次)、紫花地?。ㄝ椪蘸螅?4 g/kg劑量組(單次最大給藥劑量為8 g/kg,給藥3次),每組20只,雌雄各半。禁食不禁水6 h后,各組以40 mL/kg給藥體積灌胃給予相應(yīng)受試樣品,間隔4 h給藥1次,共給藥3次。給藥當(dāng)天觀察并記錄動物4 h內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和死亡情況;以后每天觀察1次,連續(xù)14 d。主要觀察動物飲食、一般狀態(tài)、行為活動、排泄物等是否異常和死亡情況。在給藥前、給藥后第3、7和14 d對動物稱重并對體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。觀察14 d后結(jié)束頸椎脫臼處死動物,解剖后肉眼觀察動物臟器、組織的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常。

        2.2 醋酸致小鼠疼痛 參照文獻(xiàn)方法[7],取SPF級KM小鼠96只,全雄性,隨機(jī)分為溶媒對照組、阿司匹林0.4 g/kg組、紫花地?。ㄝ椪涨埃?.5、1.0、2.0 g/kg劑量組,紫花地?。ㄝ椪蘸螅?.5、1.0、2.0 g/kg劑量組,每組12只。各組小鼠均以20 mL/kg的給藥體積灌胃給予相應(yīng)受試物,溶媒對照組給予等體積純水,每天一次,連續(xù)7 d,末次給藥后1 h,以10 mL/kg給藥體積腹腔注射0.62%冰醋酸,10 min后觀察小鼠在15 min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)(以小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張,臀部抬起反應(yīng)為準(zhǔn)),并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

        2.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 參照文獻(xiàn)方法[8-9],動物分組、劑量設(shè)定和給藥頻次均同2.2所述。末次給藥后1 h,各組小鼠在右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.04 mL,左耳不涂抹作為對照。致炎后1 h脫頸椎處死小鼠,用眼科剪剪下小鼠雙耳,直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下,稱取耳片重量,以兩耳片重量之差作為腫脹度,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

        2.4 體外對常見病原致病菌MIC值測定 參照文獻(xiàn)方法[10-11],分別從菌落平板上挑取金黃色葡萄球菌ATCC29213單克隆接種于MH液體培養(yǎng)基中,挑取大腸埃希菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、肺炎鏈球菌ATCC49619單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h;而后再分別接種于MH、LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。各菌活化后,將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×105 CFU/mL,接種入96孔培養(yǎng)板中。第1孔內(nèi)加入190 μL菌液,第2~12孔內(nèi)均加入100 μL菌液。分別將受試樣品或美羅培南10 μL加入第1孔中,混勻后吸取100 μL菌液加入第2孔中,依次對倍稀釋,重復(fù)3次。同時,設(shè)立陽性對照、陰性對照、溶劑對照。其中,陽性對照僅加入相應(yīng)濃度菌液,陰性對照直接加入培養(yǎng)基,溶劑對照加入相應(yīng)濃度菌液和生理鹽水。培養(yǎng)板分別置于37 ℃養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)12 h,溶液清亮表示陰性(-),溶液混濁表示陽性(+);讀出抑制細(xì)菌生長的最低樣品濃度(Minimal Inhibition Concentration,MIC)即為最小抑菌濃度。

        2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 溶媒對照組所有動物給予純水后一般狀況良好,均未見明顯異常反應(yīng)和死亡情況。小鼠灌胃給予紫花地丁輻照前、后樣品后,在4 h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng),其中紫花地丁(輻照前)24 g/kg劑量組4只雌性小鼠和2只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀,紫花地丁(輻照后)24 g/kg劑量組3只雌性小鼠和3只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀,剩余動物均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的異常反應(yīng)。毒性反應(yīng)在給藥后第2日恢復(fù)正常。觀察期14 d內(nèi),各組動物均未見明顯毒性反應(yīng)和死亡情況。觀察期結(jié)束后處死動物大體解剖觀察,各組動物組織和器官均未見明顯異常。結(jié)果顯示,各組小鼠在給藥后均未出現(xiàn)死亡,結(jié)果以最大給藥量表示。紫花地丁輻照前、后樣品小鼠24 h急性毒性試驗(yàn)的最大給藥量均為24 g/kg(8 g/kg/次,共灌胃3次,間隔4 h),相當(dāng)于成人每日口服紫花地丁輻照前、后樣品184.62 g(按體表面積折算,成人體重以60 kg計算)。觀察期內(nèi)動物體質(zhì)量變化情況見表1。

        3.2 對醋酸所致小鼠疼痛的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示:與溶媒對照組比較,紫花地丁輻照前、后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。與紫花地丁(輻照前)樣品組比較,紫花地?。ㄝ椪蘸螅悠方M小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均無明顯變化(P>0.05),結(jié)果見表2。

        3.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 試驗(yàn)結(jié)果顯示:與溶媒對照組比較,紫花地丁輻照前、輻照后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠耳腫脹度明顯減輕(P<0.01)。與紫花地?。ㄝ椪涨埃悠方M比較,紫花地?。ㄝ椪蘸螅悠方M小鼠耳腫脹度均無明顯變化(P>0.05),結(jié)果見表3。

        3.4 對常見病原致病菌MIC值的測定 試驗(yàn)結(jié)果顯示:紫花地丁輻照前、后樣品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌均具有一定抗菌作用,且重復(fù)三次結(jié)果一致,其MIC值見表4。

        4 小結(jié)

        輻照滅菌技術(shù)已發(fā)展了近40年,在食品和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中廣泛應(yīng)用[12],但輻照滅菌對中藥材化學(xué)成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確。由于缺乏相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則,輻照滅菌過程中存在超劑量輻照、重復(fù)輻照等問題,嚴(yán)重影響了藥品的質(zhì)量。已經(jīng)出現(xiàn)擅自改變產(chǎn)品滅菌工藝,而被CFDA收回藥品GMP證書的事件[13]。為解決這一問題,CFDA于2015年發(fā)布《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》,其中明確提出,輻照滅菌應(yīng)遵循“必要、科學(xué)、合理”的原則。任何單位或藥企采用輻照技術(shù)對中藥進(jìn)行滅菌,必須通過研究來證明輻照滅菌對產(chǎn)品質(zhì)量、穩(wěn)定性和生物學(xué)性質(zhì)沒有影響,必要時采用與適應(yīng)證相關(guān)的藥效指標(biāo),詳細(xì)闡述其必要性、科學(xué)性和合理性;對于含有不穩(wěn)定或有毒成分的中藥,更需進(jìn)行針對性研究,關(guān)注其滅菌前后的變化情況,以保證藥品安全有效[14]。

        基于上述規(guī)定,本研究結(jié)合紫花地丁的現(xiàn)代藥理學(xué)活性,對比了輻照前后紫花地丁樣品在初步安全性和鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌方面的活性。其中,急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,20 kGy輻照劑量照射紫花地丁后,樣品對小鼠的急性毒性未發(fā)生重大改變。有效性研究結(jié)果顯示:輻照前后紫花地丁均可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)和二甲苯所致小鼠耳腫,均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛抗炎活性;且輻照前后紫花地丁對4株常見菌株具有一定的抑制作用,輻照后紫花地丁的藥效學(xué)活性無顯著改變。綜上所述,在此輻照劑量對紫花地丁的安全性和有效性均無明顯改變,初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

        輻照滅菌對中藥材化學(xué)成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫花地丁輻照滅菌后,在有效性和安全性方面與輻照前沒有發(fā)生改變,因此在紫花地丁生產(chǎn)過程中,可用輻照滅菌法進(jìn)行滅菌處理,而輻照滅菌對其化學(xué)成分有無影響,還需要進(jìn)一步研究。

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