皮 立，譚 亮，曹俊虎

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.中國科學院藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810001；3.中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，青海 西寧 810001）

由野牦牛通過長期馴化而來的牦牛（Bos gruniens）是青藏高原古老的畜種，是藏民族不可或缺的生產生活資料。長期低氧嚴寒環(huán)境的適應造就了高原牦牛肉高蛋白、低脂肪、風味香醇、營養(yǎng)豐富的優(yōu)良品質[1-2]。玉樹牦牛生存于平均海拔4 000 m以上的高海拔地區(qū)，與世隔絕的自然地理環(huán)境，讓玉樹牦牛保持了較多的野牦牛特征[3-4]，玉樹牦牛體格在青海省4 個地方品種中最大。遠離城市的自然環(huán)境造就了玉樹牦牛肉綠色無污染、肉香濃郁、風味香醇的優(yōu)良食用品質，成為高品質牦牛肉的代表。

玉樹牦牛的研究主要集中在疫病防治[5-8]、抗逆生理[9-10]和飼養(yǎng)繁殖[11-14]等方面，對牦牛肉揮發(fā)性風味成分的研究重點在加工過程中肉風味的變化[15-16]。對不同性別舍飼牦牛肉的營養(yǎng)和食用品質分析結果表明，母牛的肌內脂肪含量、鮮味氨基酸含量以及粗蛋白含量均高于公牛[17]。研究不同性別西門塔爾牛肉質差異發(fā)現(xiàn)，母牛脂肪酸含量高、剪切力和水分含量低，肉質優(yōu)于公牛[18]。然而，關于不同性別牦牛肉風味成分研究鮮見報道。

風味作為肉的重要品質指標，直接影響人們的購買意向。決定牦牛肉風味品質優(yōu)劣的因素很多，主要與年齡、性別、生存環(huán)境、飼養(yǎng)方式和牦牛品種等有關。開展不同性別牦牛肉揮發(fā)性風味的研究，從中挖掘出不同性別牦牛肉風味的差異化合物，為擴充牦牛肉品質評價、分級和標準制訂提供數(shù)據(jù)基礎，可為牦牛肉資源的可持續(xù)開發(fā)利用與肉質加工提供數(shù)據(jù)支撐，為推動玉樹牦牛肉產業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

本研究以不同性別玉樹牦牛為對象，對產自治多縣的玉樹牦牛肉應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）技術進行揮發(fā)性化合物檢測，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和氣味活度值（odor activity value，OAV），對不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分進行區(qū)分鑒定，篩選不同性別玉樹牦牛肉的關鍵風味化合物，為玉樹牦牛肉品質控制增加新的理論依據(jù)，并為進一步擴大玉樹牦牛肉產品的質控指標提供科學的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2022年9月，隨機挑選在青海省玉樹州治多縣境放牧飼養(yǎng)的4～5 歲健康公、母牦牛各3 批次，共6 頭，經停食24 h、停水2 h后屠宰，屠宰后立即采集左半胴體第10～14肋骨背最長肌500 g，裝入干凈的保鮮袋中，放入冷藏箱（0～4 ℃），帶回西寧實驗室，于－20 ℃保存，樣品屠宰2 d后進行檢測。

2-甲基-3-庚酮 上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Thermo 1300/TSQ8000Evo型氣相色譜三重四極桿質譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；SPME裝置 上海安譜實驗科技股份有限公司；手動固相微萃取進樣針、DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司；DB-WAX石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風味成分萃取

將肉樣在自然狀態(tài)下解凍，去除筋膜，切成肉丁，用液氮進行速凍，倒入粉碎機中進行粉碎，粉碎后稱取5 g肉樣放進20 mL樣品瓶中，并加入5 mL飽和氯化鈉溶液和2 μL 2-甲基-3-庚酮溶液（0.168 μg/mL）混合，放入轉子后振蕩并置于磁力攪拌器上，將老化好的萃取頭插入樣品瓶距離樣品1 cm處，在60 ℃條件下吸附45 min后取出，并插入GC進樣口，在250 ℃條件下解吸附4 min[19-20]。

1.3.2 GC-MS條件

DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為He；載氣流速1.0 mL/min；進樣品和接口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫到200 ℃，并以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，不分流進樣；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30~600 u；溶劑延遲0 min[21-23]。

1.3.3 定性與定量分析

分析得到的質譜圖經NIST 14和Wiley Library標準質譜庫檢索定性，從中根據(jù)匹配度（＞800）、保留時間及相關文獻，人工解析并確定其化學結構，初步定性。選擇質量濃度0.168 μg/mL的2-甲基-3-庚酮作為內標，按內標物峰面積對每個化合物進行定量分析。

1.3.4 OAV計算

OAV按下式計算[24-25]。

式中：Ci為化合物含量/（μg/kg）；OTi為該化合物在水中的嗅覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和PCA，采用單因素方差分析，用最小顯著性差異法分析作多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析。

2 結果與分析

2.1 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分比較

由表1可知，共鑒定揮發(fā)性化學成分62 種，其中醛類17 種、酮類7 種、醇類10 種、烴類14 種、含硫化合物5 種、含氮含氧雜環(huán)化合物3 種和其他化合物6 種。玉樹公、母牦牛肉共有組分52 種，主要為醛類、醇類、烴類和其他化合物。蔡雨靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛肉揮發(fā)性風味成分主要由醛類、醇類和烴類構成，與本研究結果一致。朱青云等[27]報道，牦牛肉背最長肌揮發(fā)性風味成分主要由醛類、酮類、醇類和烴類組成，其中醛類含量最高，醇類和烴類含量較高。

表1 不同性別玉樹牦牛肉中揮發(fā)性風味成分含量（n=3）Table 1 Contents of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats (n = 3) ng/g

由圖1可知，母牦牛肉揮發(fā)性成分總量高于公牦牛肉。玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分含量由多到少依次為醛類、醇類、烴類、其他化合物、酮類、含氮含氧雜環(huán)化合物、含硫化合物。母牦牛肉揮發(fā)性風味成分中含硫化合物、酮類、醇類和含氮含氧雜環(huán)化合物均高于公牦牛肉。公牦牛肉中醛類和烴類高于母牦牛肉，但差異不顯著。

圖1 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性成分種類比較Fig. 1 Composition of volatile flavor components of male and female Yushu yak meats

玉樹牦牛肉中醛類物質檢出種類最多，共17 種，主要由壬醛、苯甲醛和十六醛等組成。公牦牛肉醛類物質含量高于母牦牛肉，但差異不顯著。醛類物質由脂質氧化產生，由于其閾值較低，對肉類香氣貢獻大[28]。玉樹牦牛肉醛類物質含量高，公、母牦牛的醛類化合物占比分別為57.77%、45.28%，遠高于青海海晏牦牛的31.13%[21]、西藏斯布牦牛的24.31%[29]和西藏當雄牦牛的19.5%[30]。醛類化合物是玉樹牦牛肉的主要特征風味成分。

玉樹牦牛肉中醇類化合物主要有1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和3,7,11-三甲基-1-十二醇。公牦牛肉中醇類化合物的含量和種類均低于母牦牛肉。醇類化合物也來源于脂肪氧化降解。1-辛烯-3-醇是重要的醇類化合物，其閾值低，對香氣貢獻大。母牦牛肉中1-辛烯-3-醇含量顯著高于公牦牛肉（P＜0.05）。其他醇類化合物由于閾值較高，其對牦牛肉香氣的貢獻可忽略不計。

玉樹牦牛肉中酮類主要有2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）、4-苯基-2-丁酮等。3-羥基-2-丁酮具有濃郁的奶香[31]，讓肉香味更豐富。玉樹母牦牛肉的3-羥基-2-丁酮含量顯著高于玉樹公牦牛肉，其香味更濃郁。

綜合分析可認為，玉樹母牦牛肉揮發(fā)性成分品質更好。

2.2 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分PCA結果

PCA的主要目的是剔除主成分中的隨機誤差，從而降低復雜問題的維數(shù)，并且最小化測量誤差的影響[32-34]。對玉樹公母牦牛肉揮發(fā)性風味成分進行PCA，篩選關鍵揮發(fā)性成分。

由圖2可知，玉樹公、母牦牛肉明顯分離，聚為2類，其中母牦牛肉分別第1、4象限，公牦牛肉分布第2、3象限。由表3可知，從玉樹牦牛肉揮發(fā)性成分中提出3 個主成分，累計貢獻率為99.78%，其中PC1方差貢獻率為89.37%，在3 個主成分中貢獻率最高，能夠代表玉樹公母牦牛肉揮發(fā)性成分。PC1中貢獻最大是辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、乙偶姻、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇（表4）。11 種關鍵揮發(fā)性風味成分由4 種醛類、4 種醇類、1 種烴類、1 種醚類和1 種酮類組成，可見醛類和醇類對玉樹公母牦牛肉揮發(fā)性風味的貢獻最大。

圖2 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分的PCA圖Fig. 2 PCA plot of volatile flavor compounds in male and female Yushu yak meats

表3 玉樹牦牛肉揮發(fā)性成分PCA中主成分特征值、貢獻率和累計貢獻率Table 3 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of first three principal components for volatile flavor components in Yushu yak meat

表4 主成分的旋轉矩陣權重系數(shù)Table 4 Rotation matrix of principal components in terms of weight coefficient

蔡雨靜等[26]在玉樹牦牛肉前胸、前腿、背部、后腿4 個部位肉中共檢測出57 種揮發(fā)性化合物，通過PCA篩選出6 種關鍵風味化合物，分別為苯甲醛、壬醛、2-乙基-1-己醇、間二甲苯、烯丙基甲基硫醚、2-乙酰吡咯，可用于區(qū)分玉樹牦牛后腿肉和其他部位肉，其中壬醛、2-乙基-1-己醇是所有部位肉的共有關鍵風味化合物。朱青云等[27]對青海大通、剛查、天峻、祁連和甘德5 個地區(qū)牦牛肉3 個部位肉進行分析，共檢測出34 種揮發(fā)性化合物，經PCA篩選出8 種化合物，十六醛、十八醛、壬醛、苯甲醛、正辛醇、2,3-戊二酮、乙偶姻、己酸是牦牛肉的關鍵揮發(fā)性風味成分。該結果中有4 種化合物與玉樹公母牦牛肉的關鍵揮發(fā)性成分相同。導致這些結果差異的原因，不但與牦牛不同產地的海拔和水熱條件有關，還與采樣部位、萃取頭類型和樣品前處理方法有關。

2.3 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分的OPLS-DA

OPLS-DA是一種多因變量對多自變量的統(tǒng)計方法，相對于無監(jiān)督的PCA，其優(yōu)點是可通過預設分類，盡可能去除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響，使模型更易于解釋[35-36]。

以牦牛肉中62 種揮發(fā)性風味成分為因變量，牦牛性別為自變量，進行OPLS-DA，由圖3可知，玉樹公、母牦牛肉被有效區(qū)分，其中母牦牛肉樣品分布在第1、4象限，公牦牛肉樣品分布在第2、3象限，為0.984，為1，模型預測指數(shù)（Q2）為0.996，模型擬合結果可接受[36]。經過200 次置換檢驗，Q2回歸線與縱軸相交線小于零，模型不存在過擬合，模型驗證有效。認為該結果可用于區(qū)分不同性別玉樹牦牛肉的揮發(fā)性風味成分。

圖3 不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分的OPLS-DA（A）和模型交叉驗證結果（B）Fig. 3 OPLS-DA plot (A) and permutation test (B) of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats

圖4 玉樹牦牛肉62 種揮發(fā)性風味物質的VIP值Fig. 4 VIP values of 62 volatile flavor compounds in Yushu yak meat

VIP值可以反映風味物質對模型分類的貢獻程度[37]，VIP＞1可認為該變量為該判別模型的潛在差異物質，且VIP值越大說明該物質在判別過程中的貢獻越大。根據(jù)VIP值確定14 種物質作為潛在差異物質（表5），包括4 種醛類（十六醛、壬醛、苯甲醛、十五醛）、5 種醇類（3,7,11-三甲基-1-十二醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、反-2-辛烯-1-醇、2-己基-1-己醇）、2 種酮類（4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮）、1 種烴類（十三烷）、1 種酸類（乙酸）及1 種酚類（丁基羥基甲苯）。這14 種關鍵差異風味化合物與PCA比較有7 種化合物（3 種醛類、4 種醇類）相同，表明兩種多元統(tǒng)計方法得到的結果相似。玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味成分中醛類、醇類和酮類含量較高，尤其醛類和酮類由于閾值低，對揮發(fā)性風味的貢獻更大。

表5 不同性別玉樹牦牛肉的特征風味物質OAVTable 5 OAVs of characteristic flavor components in male and female Yushu yak meats

OAV主要用于衡量化合物在揮發(fā)性風味中的貢獻程度[38]。由表5可知，OAV＞1的化合物有十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮；玉樹公牦牛中苯甲醛OAV＞1；2-己基-1-己醇、乙酸的OAV＜0.1，認為其對牦牛肉揮發(fā)性風味的貢獻不大。其余4 種物質由于飽和醇、酚類和烷烴的閾值均較高，對揮發(fā)性風味貢獻不大，可以不考慮其對玉樹牦牛肉風味的影響。

玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味的5 種關鍵差異物中OAV最高的3 種化合物是十六醛、壬醛和1-辛烯-3-醇。十六醛OAV值遠高于其他4 種化合物，對玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味的貢獻最大，為牦牛肉提供了果香。壬醛和1-辛烯-3-醇也是玉樹牦牛肉的關鍵揮發(fā)性風味成分，為牦牛肉提供柑橘和蘑菇香味。比較玉樹公牦牛和玉樹母牦牛關鍵風味成分的OAV發(fā)現(xiàn)，玉樹母牦牛中1-辛烯-3-醇、壬醛的OAV高于玉樹公牦牛，表明玉樹母牦牛肉的揮發(fā)性風味中水果香和蘑菇味更濃郁。

3 結 論

采用HS-SPME-GC-MS技術分析不同性別玉樹牦牛肉的揮發(fā)性物質，運用PCA和OPLS-DA結合OAV，篩選不同性別玉樹牦牛肉的關鍵差異風味化合物。玉樹牦牛肉中共鑒定出揮發(fā)性風味成分62 種，主要為醛類、醇類和烴類。玉樹牦牛肉中醛類化合物占比約為50%，遠高于其他產地牦牛肉，醛類化合物是玉樹牦牛肉的重要特征成分。比較玉樹公、母牦牛肉揮發(fā)性風味成分含量認為，母牦牛肉的風味品質更好。對不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性成分進行分析，通過PCA篩選出11 種關鍵風味化合物，分別為辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、3-羥基-2-丁酮、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇；通過OPLS-DA結合OAV，確定十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮5 種物質為不同性別玉樹牦牛肉揮發(fā)性風味關鍵差異物質。本研究結果對于區(qū)分不同性別玉樹牦牛肉風味成分提供了科學依據(jù)，也為玉樹牦牛肉風味品質控制和提高提供了數(shù)據(jù)支持。