王育盛

（南昌大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,南昌 330031）

因?yàn)槟退幧锏陌l(fā)展速度超過了新型有效抗菌藥物的開發(fā)速度，細(xì)菌感染對(duì)人類健康的威脅越來越大。經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，頭孢菌素已經(jīng)發(fā)展到了第5 代。至今為止，頭孢菌素仍占抗感染藥物數(shù)量的最大份額：全球累計(jì)批準(zhǔn)了50 多種頭孢菌素藥物，幾乎占所有批準(zhǔn)的抗菌藥物的一半。但近幾年傳染病研究及抗菌藥物研發(fā)的疲軟和抗菌新藥批準(zhǔn)數(shù)量減少變得越發(fā)明顯。了解抗菌藥物發(fā)現(xiàn)過程有利于抗菌藥物的進(jìn)一步發(fā)展。

1 抗菌藥物研發(fā)歷史過程

1.1 抗菌藥物研發(fā)的輝煌歷史

抗菌藥物研發(fā)的高峰期是從19 世紀(jì)30 年代到19 世紀(jì)80 年代，從歷史數(shù)據(jù)看，抗菌藥物在商業(yè)上是非常成功的。2000 年，廣譜抗菌藥和增強(qiáng)抗菌藥是繼抗抑郁藥和抗?jié)兯幹箐N量第三大的治療品種。2000 年美國最暢銷的50 種藥物中有5種是抗菌藥物，包括奧格門汀、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、左氧氟沙星和克拉霉素。奧格門汀在2001 年的銷售額為18 億美元，是當(dāng)年葛蘭素史克的第二大銷售藥物。作為對(duì)比，當(dāng)時(shí)腫瘤藥物銷量作為一個(gè)整體甚至沒有被列入2000 年治療類別銷售的前25[1]。

1.2 抗菌藥物研發(fā)管線現(xiàn)狀及原因

從19 世紀(jì)90 年代開始，被批準(zhǔn)的新抗菌藥物數(shù)量開始下降，自21 世紀(jì)，隨著當(dāng)前抗菌藥物的耐藥性不斷增加，人們擔(dān)心很快會(huì)面臨沒有有效藥物治療細(xì)菌感染的狀況。2013 年，美國疾控中心CDC 發(fā)布的一份報(bào)告顯示每年美國有200 多萬人感染抗藥性細(xì)菌，每年導(dǎo)致23 萬人死亡[2]。全球每年因耐藥性感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)約為70 萬人[3]。近年來，全球藥物研發(fā)支出逐年增加，但抗菌新藥研究與開發(fā)停滯不前。全球抗菌藥物研發(fā)面臨的最大的問題是沒有制藥企業(yè)愿意制造新的抗菌藥物，導(dǎo)致新抗菌藥物種類嚴(yán)重不足。與其他藥物相比，抗菌藥物的購買成本極低，但開發(fā)、試驗(yàn)并將藥物推向市場(chǎng)的成本卻非常高。候選抗菌藥物從臨床前階段發(fā)展到臨床階段大約需要10～15 年，耗資約10 億美元，且大多數(shù)新藥在上市后的平均2～3 年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)耐藥性。2021 年，世界衛(wèi)生組織抗生素研發(fā)管線分析指出，世界在開發(fā)新的、急需的抗生素以應(yīng)對(duì)耐藥性感染方面幾乎沒有取得任何進(jìn)展。

醫(yī)藥行業(yè)注意到藥物研發(fā)方向從20 世紀(jì)80年代和90 年代的治療重點(diǎn)（傳染病、潰瘍和心理健康）轉(zhuǎn)移到現(xiàn)今的腫瘤學(xué)。一些大的世界知名制藥企業(yè)紛紛裁撤研發(fā)管線，幾乎完全退出抗菌藥物市場(chǎng)。如2016-2019 年，制藥企業(yè)巨頭賽諾菲（Sanofi）、諾華（Novartis）和阿斯利康（AstraZeneca）等均宣布退出抗菌藥物研發(fā)管線，轉(zhuǎn)而進(jìn)入利潤更為豐厚的腫瘤或其他研發(fā)領(lǐng)域。

抗菌藥物研發(fā)遲緩原因首先是抗菌藥物的監(jiān)管環(huán)境變得越來越具有挑戰(zhàn)性。因?yàn)樗谢颊叨急仨毥邮芊e極治療，不能在傳染病中進(jìn)行安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)。其次與抗菌藥物監(jiān)管環(huán)境相比，癌癥及腫瘤藥物的監(jiān)管環(huán)境則變得大不相同，由于在21 世紀(jì)00 年代開發(fā)了癌癥新療法，與抗菌藥物治療傳染病相比，癌癥療法的監(jiān)管環(huán)境變得相對(duì)寬松。此外，癌癥療法傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)上具有嚴(yán)重的副作用。即使具有使人衰弱的副作用，但有效的治療藥物也可能獲得批準(zhǔn)甚至提前上市。最后醫(yī)保報(bào)銷比例相對(duì)較低是抗菌藥物產(chǎn)生的收入不足的主要原因之一。目前的抗菌治療每療程從2 000 美元到6 000美元不等。相較而言舊的仿制藥則要便宜得多，并且不涉及耐藥性。因此抗菌藥物一般只被用作一線治療。此外，由于對(duì)細(xì)菌耐藥性的擔(dān)憂，新的抗菌藥物很少被使用，通常新抗菌藥物僅作為舊治療方案失敗時(shí)的最后手段。只有當(dāng)舊療法產(chǎn)生耐藥性，這些藥物才會(huì)得到更廣泛的使用。

總之，腫瘤藥物在有利的監(jiān)管環(huán)境和巨額財(cái)務(wù)回報(bào)率條件下，迅速改變了制藥行業(yè)的關(guān)注點(diǎn)。到2015 年，全球銷量前100 種藥物中沒有一種抗菌藥物，而抗癌藥物有19 種。目前由默克公司銷售的達(dá)托霉素，是2015 年銷量最高的抗菌藥物，銷售額為1.1 美元。21 世紀(jì)00 年代初期推出的5 種抗菌藥物有條件上市，2017 年以來，世衛(wèi)組織僅批準(zhǔn)了12 種抗菌藥物，2021 年針對(duì)優(yōu)先病原體的臨床開發(fā)中只有27 種新抗菌藥物，低于2017 年的31 種產(chǎn)品。與腫瘤治療藥物相比，新抗菌藥物處于推出疲軟和總體投資回報(bào)不佳的狀態(tài)[4]。

1.3 抗菌藥物研發(fā)的重振

鑒于越來越多的耐藥細(xì)菌構(gòu)成的重大醫(yī)學(xué)威脅，各國政府部門通過一系列舉措來激勵(lì)抗菌藥物研發(fā)。包括2010 年美國成立生物醫(yī)學(xué)高級(jí)研究與發(fā)展管理局（Biomedical Advanced Research and Development Authority，BARDA），美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)對(duì)于被指定為合格傳染病產(chǎn)品（qualified infectious disease products,QIDP）的藥物實(shí)行快速通道，在藥物開發(fā)期間增加了FDA 的準(zhǔn)入，NDA 的優(yōu)先審查以及額外5 年的市場(chǎng)獨(dú)占權(quán)等。2020 年6 月，英國啟動(dòng)全球首個(gè)抗生素“訂購”計(jì)劃：英國國民醫(yī)療服務(wù)體系（The National Health Service of the United Kingdom,NHS）每年向美國輝瑞公司和日本鹽野木公司2 家制藥公司投入1 000萬英鎊的固定研發(fā)費(fèi)用，以激勵(lì)新抗菌藥物的開發(fā)；2020 年9 月，瑞典啟動(dòng)對(duì)新抗生素研發(fā)、測(cè)試和上市簽訂合同的“訂購”模式，以確?？股毓?yīng)；2021 年，美國通過《啟動(dòng)抗生素訂購以終止耐藥性激增（PASTEUR）法案》。這些激勵(lì)措施、計(jì)劃和法案，將有助于重振行業(yè)、激活抗菌藥物市場(chǎng)，并努力構(gòu)建一個(gè)可以應(yīng)對(duì)超級(jí)細(xì)菌的強(qiáng)大“武器庫”[1]。

2 頭孢菌素藥物的發(fā)展過程

2.1 頭孢菌素的發(fā)現(xiàn)

頭孢菌素發(fā)展史大約開始于70 年前，當(dāng)時(shí)意大利科學(xué)家Giuseppe.Brotzu 發(fā)現(xiàn)從污水出口附近的海水中培養(yǎng)的頂頭孢霉菌含有對(duì)傷寒沙門氏菌（引起傷寒的細(xì)菌）具有活性的化合物。1948 年牛津大學(xué)的Abraham、Newton 和同事經(jīng)聯(lián)系從Brotzu 得到菌株并開始研究，從頭孢菌素菌株中分離出許多化合物，包括他們命名為頭孢菌素P1～P5 的的5 個(gè)密切相關(guān)化合物，以及單獨(dú)的化合物頭孢菌素C、N、P（見圖1），后來經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)頭孢菌素N 和P 其實(shí)不是頭孢菌素，其中頭孢菌素P 是一種甾體，而頭孢菌素N 其實(shí)是青霉素N。該團(tuán)隊(duì)在1961 年根據(jù)紅外光譜、元素分析和創(chuàng)造性降解研究確定了頭孢菌素C 的結(jié)構(gòu)[5]，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)頭孢菌素的核心是7-ACA（7-氨基頭孢烷酸），在研究中證實(shí)與青霉素核心結(jié)構(gòu)6-APA（6-氨基青霉烷酸）相似。

圖1 頭孢菌素化合物Fig. 1 Cephalosporin Compounds

雖然頭孢菌素C 的活性不足以開發(fā)為抗菌藥物，因?yàn)槠鋵?duì)金黃色葡萄球菌的活性僅為芐青霉素的0.1%左右。但與青霉素相比頭孢菌素C 有著獨(dú)特的重要特性：頭孢菌素C 在酸性溶液中的穩(wěn)定性有所提高，并且對(duì)青霉素酶具有抗降解性。隨著第一批頭孢菌素藥物上市，頭孢菌素C 第3 個(gè)重要特性也被發(fā)現(xiàn)，即出現(xiàn)青霉素常見的嚴(yán)重過敏反應(yīng)的患者要少得多。這3 個(gè)關(guān)鍵特性表明頭孢菌素C的類似物相對(duì)于已經(jīng)廣泛使用的青霉素藥物可能更具有優(yōu)勢(shì)。

2.2 頭孢菌素藥物開發(fā)過程

2.2.1 頭孢菌素7-ACA 工藝發(fā)展及頭孢噻吩的發(fā)現(xiàn)

1961 年，當(dāng)科學(xué)家們解析確證頭孢菌素C 的分子式時(shí)，科學(xué)家已經(jīng)知道青霉素的酰胺水解產(chǎn)物6-APA(6-氨基青霉酸)可以通過青霉素酶促水解發(fā)酵進(jìn)行制備。該中間體被證明可作為制備具有改進(jìn)性能的新青霉素類似物的支架。頭孢菌素C相應(yīng)的酰胺水解產(chǎn)物7-ACA 無法通過當(dāng)時(shí)的技術(shù)發(fā)酵制備得到，需要通過化學(xué)途徑合成，這相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性。1961 年，牛津大學(xué)的Abraham、Newton 團(tuán)隊(duì)通過用1 N 鹽酸水溶液水解2 g 頭孢菌素C 獲得少量7-ACA，然后通過離子交換色譜分離，得到微量粗品。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)7-ACA 對(duì)葡萄球菌的抗菌活性是頭孢菌素的幾百倍[1]。

與此同時(shí)，工藝化學(xué)家考慮到β-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性，涉及直接酰胺水解的路線是不可行的。他們的工作努力集中在活化酰胺以得到一種在溫和條件下易于水解的結(jié)構(gòu)。在1962 年他們發(fā)表的創(chuàng)新兩步法（見圖2）[6]，涉及用亞硝酰氯（NOCl）處理頭孢菌素C，經(jīng)胺重氮化，然后插入酰胺羰基生成中間體亞氨基醚。亞硝酰氯是一種氧化劑，可以在水解之前通過蒸發(fā)輕松去除。在乙酸作為溶劑條件下，反應(yīng)分離得到7-ACA（產(chǎn)率為7%）。正如經(jīng)常發(fā)生的那樣，一旦實(shí)現(xiàn)了第1 個(gè)突破，改進(jìn)就會(huì)迅速跟進(jìn)。當(dāng)溶劑改為頭孢菌素C 在其中具有更大溶解度的甲酸時(shí)，產(chǎn)率提高到40%。使用乙腈或硝基烷烴作為溶劑產(chǎn)率提高至50%，并且用甲醇淬滅殘留的亞硝酰氯避免了濃縮至干燥的繁瑣工藝。

圖2 頭孢菌素C 轉(zhuǎn)化為7-ACA 的工藝Fig. 2 Process for Conversion of Cephalosporin C to 7-ACA

科學(xué)家們繼續(xù)開發(fā)將頭孢菌素C 轉(zhuǎn)化為7-ACA 的工藝。到1969 年，優(yōu)化得到了一條總產(chǎn)率＞90%的路線，其中涉及羧酸和胺基團(tuán)的硅烷化，使用五氯化磷（PCl5）將酰胺轉(zhuǎn)化為亞氨基氯化物，然后水解[7]。

19 世紀(jì)80 年代，一種允許使用頭孢菌素C 粗品為原料的兩步酶法路線（見圖3）被開發(fā)出來[1]。在酶促過程的第1 步中，頭孢菌素C 粗品經(jīng)過D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)氧化脫氨基轉(zhuǎn)化為α-酮己二酰-7-ACA。在該反應(yīng)中釋放過氧化物，誘導(dǎo)氧化脫羧得到戊二酰-7-ACA。在第2 個(gè)酶促步驟中，使用?；杆馕於?7-ACA 以產(chǎn)生7-ACA 和戊二酸。在此基礎(chǔ)上Boehringer Mannheim 開發(fā)了一條使用固定在聚合物上的DAAO 催化的高效工藝，在步驟1 中有94%的轉(zhuǎn)化率，在步驟2 中有96%的轉(zhuǎn)化率，每步反應(yīng)時(shí)間都只有30 min 左右，大大提高了產(chǎn)能。

圖3 頭孢菌素C 到7-ACA 的生物催化轉(zhuǎn)化Fig. 3 Biocatalytic Conversion of Cephalosporin C to 7-ACA

憑借可用于生產(chǎn)7-ACA 的工藝，禮來的藥物化學(xué)家制備和評(píng)估各種酰胺側(cè)鏈，最終促成了頭孢噻吩（Cephalothin）臨床開發(fā)和成功上市。在7-ACA 結(jié)構(gòu)發(fā)表后，頭孢菌素藥物得到快速發(fā)展[8]。1964 年頭孢噻吩作為第1 代頭孢藥物被批準(zhǔn)上市銷售。如今大部分7-ACA 都是通過生物催化路線制造的。

2.2.2 頭孢菌素：GCLE 的發(fā)現(xiàn)和工藝發(fā)展

據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止至2000 年，全球大約累計(jì)生產(chǎn)了200 萬kg 的7-ACA。雖然它是許多科學(xué)家早期頭孢菌素藥物開發(fā)所喜歡使用的起始物料，但從20世紀(jì)80 年代開始，科學(xué)家們更傾向于選擇使用更易得的起始物料：3-氯甲基-7-(2-苯基乙酰氨基)-3-頭孢烯-4-甲酸4-甲氧基芐酯(3-Chloromethyl-7-(2-phenylacetamido)-3-cephem-4-carboxylic Acid 4-Methoxybenzyl Ester，GCLE)進(jìn)行開發(fā)。GCLE的烯丙基氯可以輕松修飾10 位，而羧基的保護(hù)有更廣泛的范圍可供選擇，進(jìn)而使在分子的其他位置建立結(jié)構(gòu)多樣性成為可能。

GCLE 的工藝合成一般是以青霉素G 鉀鹽作為起始原料開始制備的。最早將青霉素作為原料合成制備頭孢菌素結(jié)構(gòu)的化學(xué)反應(yīng)是由禮來團(tuán)隊(duì)開發(fā)的（見圖4）。其描述的路線是建立在早期研究工作基礎(chǔ)上，盡管存在許多變體但該路線說明了該化學(xué)反應(yīng)的常見轉(zhuǎn)化順序和使用的試劑種類。

圖4 從青霉素G 到GCLE 的轉(zhuǎn)化途徑Fig. 4 Route to GCLE from Penicillin G

該方法是從青霉素G 鉀鹽開始，第一步經(jīng)過上對(duì)甲氧基芐基（P-methoxy benzyl，PMB）得到青霉素G 羧酸對(duì)甲氧基芐基酯3。優(yōu)選對(duì)甲氧基芐基是因?yàn)閷?duì)甲氧基芐基基團(tuán)可以在最后一步脫保護(hù)基得到頭孢菌素產(chǎn)物。在對(duì)甲氧基芐基保護(hù)后下一步用過氧乙酸將硫氧化成亞砜4。亞砜與開環(huán)的亞磺酸5 處于互變平衡狀態(tài)，當(dāng)亞磺酸5 被2-巰基苯并噻唑捕獲形成6，然后使用苯亞磺酸轉(zhuǎn)化為硫代磺酸鹽7。7 經(jīng)氯化得到烯丙基氯8，它與氨反應(yīng)通過在4 位去質(zhì)子化，然后通過雙分子親核取代反應(yīng)（substitution nucleophilic 2，SN2）取代硫生成的碳負(fù)離子以釋放苯亞磺酸鹽，使六元環(huán)閉環(huán)得到GCLE，文獻(xiàn)報(bào)道氨是這種轉(zhuǎn)化的獨(dú)特堿，產(chǎn)率為93%，遠(yuǎn)高于篩選的其他堿。

隨著技術(shù)發(fā)展，GCLE 的生產(chǎn)成本已經(jīng)大幅降低。GCLE 是繼7-ACA 之后合成頭孢菌素藥物又一新的重要中間體[9]，對(duì)于新的頭孢藥物開發(fā)也十分關(guān)鍵，也將有更廣闊的用途和市場(chǎng)。

2.2.3 頭孢類藥物分類

鑒于在頭孢噻吩（Cephalothin）發(fā)現(xiàn)后的20 年間批準(zhǔn)了大量頭孢菌素藥物。1987 年，根據(jù)微生物學(xué)特征，Williams 對(duì)頭孢菌素藥物引入了分類系統(tǒng)，為醫(yī)生給患者選擇適當(dāng)藥物提供了依據(jù)。頭孢菌素現(xiàn)在按“代”分類，現(xiàn)已達(dá)到5 代。頭孢菌素分類及典型藥物見表1[1]。

表1 5 代典型的頭孢菌素藥物Tab.1 Five Generations of Typical Cephalosporin Drugs

第1 代頭孢菌素類藥物主要對(duì)葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有活性，如頭孢噻吩。到1970 年代，因?yàn)榧?xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的進(jìn)化，使耐藥性變得常見，使得第1 代頭孢菌素類藥物無效。第2 代藥物的頭孢菌素藥物是在第一代頭孢藥物官能團(tuán)上修飾得到，一個(gè)重要改進(jìn)是在側(cè)鏈中引入了一個(gè)α-烷氧基亞氨基。頭孢呋辛是第2 代頭孢菌素藥物典型代表。其新引入的基團(tuán)使β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性提高了2 個(gè)數(shù)量級(jí)，而新引入的Z-肟結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性比E-肟穩(wěn)定近2 萬倍。第3 代藥物的烷氧基亞氨基側(cè)鏈更大更復(fù)雜，目的是使藥物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶和噻唑鏈穩(wěn)定作用進(jìn)一步加強(qiáng)，如頭孢噻肟。它針對(duì)革蘭氏陰性生物改進(jìn)而提供活性。為了加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的活性，第3 代頭孢藥物引入了鎓鹽結(jié)構(gòu)。第4、5 代頭孢藥物中，中鎓鹽片段更為普遍，它們對(duì)耐藥菌具有更高的功效，頭孢洛扎就是第5 代頭孢藥物的典型代表。

3 頭孢洛扎的發(fā)現(xiàn)

3.1 頭孢洛扎的化學(xué)結(jié)構(gòu)

頭孢洛扎分子結(jié)構(gòu)如下（見圖5）

圖5 頭孢洛扎Fig. 5 Ceftolozane

頭孢洛扎化學(xué)分子式為C23H30N12O8S2，分子量為666.69，頭孢洛扎上市藥品一般為硫酸鹽，即硫酸頭孢洛扎，分子式為C23H31N12O8S2+·HSO4-，CAS 號(hào)為936 111-69-2。

3.2 頭孢洛扎的發(fā)現(xiàn)及研究

頭孢洛扎是由Astellas Pharma 和Wakunaga Pharma 發(fā)現(xiàn)的。2007 年，Astellas Pharma 將頭孢洛扎商業(yè)開發(fā)權(quán)益轉(zhuǎn)給了Calixa，Calixa 開始將頭孢洛扎與他唑巴坦聯(lián)合開發(fā)成抗感染復(fù)方制劑。2009 年，由于Cubist 兼并收購，Calixa 成為了其子公司，并于2013 年，從Astellas Pharma 手中買斷了頭孢洛扎硫酸鹽及頭孢洛扎硫酸鹽與他唑巴坦聯(lián)合開發(fā)的權(quán)利，賦予Cubist 全球權(quán)利。2015 年默沙東收購了Cubist，獲得了頭孢洛扎全部的開發(fā)權(quán)益[10-11]。

Zerbaxa 是頭孢洛扎和他唑巴坦的復(fù)方制劑[12-13]，在2014-2015 年，相繼通過FDA 和歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）審批上市，用于治療尿路和腹腔感染。頭孢洛扎是典型的第5 代頭孢藥物，用于治療對(duì)前代抗菌藥物產(chǎn)生抗性的革蘭氏陰性菌（包含銅綠假單胞菌和耐β-內(nèi)酰胺類腸桿菌）引起的感染。與之聯(lián)合使用的他唑巴坦則是一款經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物[14]。

頭孢洛扎是與頭孢他啶相似的抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)與頭孢他啶相似，對(duì)銅綠假單胞菌具有高效的抗菌作用。美國和歐洲醫(yī)學(xué)中心收集到2 968 份肺炎標(biāo)本并研究藥物抗菌活性，研究數(shù)據(jù)表明與其他藥物相比，頭孢洛扎與他唑巴坦復(fù)方藥物對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性最佳，其次是美羅培南。隨機(jī)、雙盲、多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)比較了頭孢洛扎/他唑巴坦與甲硝唑/美羅培南治療復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染（complicated intra-abdominal infections，cIAI）的療效，結(jié)果顯示2 組患者均取得滿意的療效。根據(jù)20 多個(gè)國家200 多個(gè)臨床中心1 000 多例患者的臨床試驗(yàn)，比較了頭孢洛扎/他唑巴坦與左氧氟沙星治療尿路感染或腎盂腎炎的治療效果，臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示頭孢洛扎/他唑巴坦復(fù)方制劑效果明顯優(yōu)于左氧氟沙星。頭孢洛扎體外抗菌作用與其他頭孢菌素抗菌作用機(jī)制一致，都是通過抑制青霉素結(jié)合蛋白發(fā)揮殺菌作用，通過抑制細(xì)胞壁合成，最終細(xì)胞裂解死亡[15]。

4 頭孢洛扎工藝路線研究進(jìn)展

最新的Cubist 和默沙東的專利申請(qǐng)中主要描述了3 種制備頭孢洛扎的方法。

4.1 方法1：從GCLE 作為起始物料制備頭孢洛扎

在Cubist 和默沙東公司專利中描述的第1 條路線與GCLE 制備頭孢洛扎的藥物化學(xué)路線相同。專利實(shí)驗(yàn)部分提供了詳細(xì)的制備過程，提出了對(duì)合成頭孢洛扎化學(xué)工藝的挑戰(zhàn)和后處理及純化的見解思路，其分步制備過程如下。

4.1.1 GCLE 到ACLE 的轉(zhuǎn)換

盡管7-氨基-3-氯甲基-3-頭孢-4-羧酸對(duì)甲氧基芐基酯鹽酸鹽（7-amino-3-chloromethyl-3-cephem-4-carboxylic acid p-methoxybenzyl ester,ACLE)是一種市售物料，但其制備方法之前未在文獻(xiàn)中得到很好的記錄。GCLE 側(cè)鏈的水解在公開專利中進(jìn)行了詳細(xì)描述。每個(gè)都遵循類似于頭孢菌素C側(cè)鏈裂解的過程，即形成亞氨基氯化物，然后水解。

美國專利US20160176897 描述了270 kg 規(guī)模GCLE 轉(zhuǎn)化到ACLE 的工藝（見圖6）[16]。實(shí)驗(yàn)方案如下：將五氯化磷（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為2.0）加入二氯甲烷并冷卻至-10 ℃，然后緩慢加入吡啶（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為2.0）并保持溫度低于5 ℃。在-10～0 ℃的溫度下加入GCLE（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為1.0）；低溫有利于減少β-內(nèi)酰胺的C7-氨基中心的差向異構(gòu)化，當(dāng)反應(yīng)完成，得到化合物9 反應(yīng)液。將反應(yīng)體系冷卻至-20 ℃加入正丁醇（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為2.0），形成亞氨基醚化合物10。此時(shí)需要低溫條件以最大限度地減少向GCLE 的轉(zhuǎn)化。以將亞氨基-醚水解成胺得到ACLE。分層后濃縮有機(jī)層，然后加入乙酸乙酯析出得到ACLE 鹽酸鹽（產(chǎn)率：87%，純度＞97%）。結(jié)晶產(chǎn)物中的主要雜質(zhì)是2-氯-對(duì)甲氧基芐基產(chǎn)物，其中氯的親電加成發(fā)生在甲氧基的鄰位。由于該部分在三氟乙酸脫保護(hù)過程中也被裂解生成目標(biāo)產(chǎn)物，因此雜質(zhì)的含量對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量無明顯影響。

圖6 GCLE 轉(zhuǎn)化為ACLE-HCl 的過程Fig. 6 Conversion of GCLE to ACLE

4.1.2 ACLE 向中間體10 甲苯溶劑化物的轉(zhuǎn)化

噻二唑基-肟基乙酸側(cè)鏈((Z)-2-[[1-(tertbutoxycarbonyl)-1-Methylethoxy]iMino]-2-(5-AMino-[1,2,4]thiadiazol-3-yl)-acetic acid,TATD）與ACLE 的偶聯(lián)反應(yīng)在默沙東WO2016/025813專利中以99 kg 規(guī)模進(jìn)行了描述（見圖7）[17]。側(cè)鏈TATD 在3～7 ℃ N,N-二甲基乙酰胺（N,NDimethylacetamide,DMAc）中用碳酸鉀作為堿進(jìn)行甲磺酸酯化。后處理體系用乙酸乙酯稀釋，依次用1.7%鹽酸水溶液，10%氯化鈉水溶液洗滌得到化合物11 的有機(jī)相溶液。然后將有機(jī)溶液直接用于偶聯(lián)步驟，偶聯(lián)步驟在0～5 ℃水和乙酸乙酯兩相體系中進(jìn)行，用三乙胺將pH 調(diào)節(jié)至3.2～3.8。后處理添加氯化鈉固體攪拌溶解，分離水層，再用氯化鈉水溶液洗滌。然后將有機(jī)層濃縮，加入甲苯，分離出TATD-CLE 的結(jié)晶甲苯溶劑化物，反應(yīng)總產(chǎn)率為90%，純度約99%。專利中要求保護(hù)的結(jié)晶甲苯溶劑化物TATD-CLE。

圖7 ACLE 向TATD-CLE 甲苯溶劑化物的轉(zhuǎn)化Fig. 7 Conversion of ACLE to TDTD-CLE .Toluene

4.1.3 中間體TATD-CLE 向頭孢洛扎三氟乙酸鹽的轉(zhuǎn)化

27～30 ℃，中間體TATD-CLE 與吡唑側(cè)鏈（[2-[[[1-甲基-5-[(三苯甲基)氨基]-1H-吡唑-4-基]氨基甲?；鵠氨基]乙基]氨基甲酸叔丁酯，UBT，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為1.2）在N-甲基吡咯烷酮（Nmethyl-2-pyrrolidone，NMP）中與六甲基二硅脲（1,3-bis(trimethylsilyl)urea，BSU，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為3.6）和碘化鉀（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為1.8）存在條件下進(jìn)行反應(yīng)（見圖8）[17]。過程監(jiān)測(cè)中間體碘化物的生成及消耗來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行程度。反應(yīng)完成后，后處理放體系中添加二氯甲烷（dichloromethane,DCM），然后用pH=4～6 的4.4%氯化鈉水溶液（用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH）在0～5 ℃洗滌分液去除水相，0～5 ℃有機(jī)相用硫代硫酸鈉洗滌一次后再用15%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）洗滌3 次，12 的三氟乙酸鹽在二氯甲烷溶液直接用于下一步。據(jù)報(bào)道該階段溶液產(chǎn)率為48-57%[18]。

圖8 頭孢洛扎三氟乙酸鹽的制備過程Fig. 8 Preparation of Ceftolozane Trifluoroacetate

下一步將12 的三氟乙酸鹽的二氯甲烷溶液減壓濃縮，然后加入苯甲醚(0.7 體積)和三氟乙酸(5體積)以實(shí)現(xiàn)基團(tuán)：PMB、叔丁氧羰基（Tert-Butyloxycarbonyl,Boc）、三苯甲基和叔丁基（tert butyl,t-Bu）的脫保護(hù)。后處理先在-35 ℃下加入二氯甲烷后攪拌分液，去除上層二氯甲烷相。下層包含產(chǎn)品和三氟乙酸，而上層包含二氯甲烷和苯甲醚。將乙腈加入到下層產(chǎn)物層中，然后通過滴加甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）使頭孢洛扎三氟乙酸鹽結(jié)晶析出。（產(chǎn)率63%，純度78%）。

4.1.4 轉(zhuǎn)化為頭孢洛扎硫酸鹽

頭孢洛扎三氟乙酸鹽向硫酸鹽的轉(zhuǎn)化過程專利中進(jìn)行了詳細(xì)描述[19]。為了去除不溶性雜質(zhì)，將三氟乙酸鹽溶解在水中，并用氨水溶液調(diào)節(jié)pH 至1.5 并攪拌20 min。添加珍珠巖，然后過濾物料，從而去除不溶性雜質(zhì)。為了去除非極性雜質(zhì)，將上述過濾后的溶液在24～26 ℃下通過型號(hào)為：HP20L的樹脂柱并用酸水(pH=1.5)洗脫。在0～8 ℃的溫度下，用氨水將產(chǎn)品溶液pH 調(diào)至6.4～7.0。經(jīng)過樹脂處理，物料純度從7%～80%提高到92%～95%。合并產(chǎn)品溶液通過膜技術(shù)（納米過濾）將產(chǎn)品溶液濃縮約至80 g/L。硫酸鹽的結(jié)晶是通過8～12 ℃向上述80 g/L 產(chǎn)品溶液中滴加硫酸（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為2.5）成鹽，然后加入異丙醇來完成產(chǎn)品析晶純化得到硫酸頭孢洛扎[20]。

4.2 方法2：逆序合成頭孢洛扎

美國專利US20140274958 中描述了另外一條頭孢洛扎合成路線[21]，該路線（見圖9）以ACLE 的水楊醛亞胺SCLE（7-水楊醛亞胺基-3-氯甲基-3-頭孢-4-羧酸對(duì)甲氧基芐基酯）為起始合成原料，它是一種由ACLE 和水楊醛制備的市售材料。在該合成路線中，兩側(cè)鏈以與之前報(bào)道路線相反的順序進(jìn)行偶聯(lián)。吡唑側(cè)鏈UBT 首先在N-甲基吡咯烷酮中在碘化鉀和雙 (三氟甲基)乙酰胺(bistrifluoroacetamide，BSA)存在條件按下與原料SCLE 進(jìn)行偶聯(lián)得到中間體13，由側(cè)鏈TATD與甲磺酰氯反應(yīng)生成甲磺酸酯11，甲磺酸酯11 與中間體13 發(fā)生取代反應(yīng)以86%的產(chǎn)率得到中間體12。此步驟相對(duì)于使用原料TATD-CLE 反應(yīng)（產(chǎn)率47%～65%），產(chǎn)率有很大提高。后續(xù)向中間體12 體系中加入甲基叔丁基醚，中間體12 結(jié)晶析出得到其三氟乙酸鹽，產(chǎn)率81%。后續(xù)中間體12按照上述路線一步驟整體脫保護(hù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為頭孢洛扎，然后進(jìn)行鹽交換和與硫酸鹽成鹽結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物硫酸頭孢洛扎。

圖9 ACLE-亞胺轉(zhuǎn)化為頭孢洛扎中間體12Fig. 9 Conversion of ACLE-Imine to Ceftolozane Intermediate 12

4.3 方法3：吡唑側(cè)鏈的C—N 交叉偶聯(lián)

在迄今為止討論的路線中，吡唑側(cè)鏈都是通過烯丙基氯的SN2 取代縮合得到的（使用碘化鉀轉(zhuǎn)化為碘化物）。默沙東專利中報(bào)告的該步驟的產(chǎn)率為47%～86%。作為替代方法，專利WO2016/025839申請(qǐng)描述了通過鈀催化的交叉偶聯(lián)形成這種鍵的方法（見圖10）[22]，產(chǎn)率提高到了92%～96%。

圖10 C-N 交叉偶聯(lián)方法制備頭孢洛扎Fig. 10 C-N cross coupling approach to ceftolozane

工藝是通過中間體TATD-CLE 與吡唑側(cè)鏈UBT 在三氟乙酸鉀、四氫呋喃、亞磷酸三-（4-二甲氨基苯基）酯和三(二亞芐基丙酮)二鈀）存在下室溫條件發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)生成中間體三氟乙酸酯14。三氟乙酸酯14 作為短暫中間態(tài)后續(xù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為中間體12。后處理通過水溶液洗滌、除鈀[23]。三氟乙酸脫對(duì)PMB、Boc、t-Bu 得到頭孢洛扎，三氟乙酸鹽固體?？偖a(chǎn)率為78%，純度為90%，后續(xù)再經(jīng)過鹽型轉(zhuǎn)化得到硫酸頭孢洛扎。

4.4 頭孢洛扎工藝路線對(duì)比及結(jié)果

經(jīng)過以上頭孢洛扎工藝合成方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，第1 條工藝合成路線遵循與原研藥物化學(xué)團(tuán)隊(duì)描述的相同的路線，雜質(zhì)多，純化難度大，且在頭孢洛扎原料藥純化過程需要采用樹脂純化納濾濃縮等操作。

第2 條路線從GCLE 的水楊醛亞胺開始，并以相反的順序附加側(cè)鏈。該路線同第1 條路線對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雖然制備中間體頭孢洛扎三氟乙酸鹽收率有了明顯提高，在后處理純化過程難度大大降低。但是合成起始物料GCLE 的水楊醛亞胺價(jià)格較高，且現(xiàn)無大批量供應(yīng)，需要自己合成制備。

第3 條路線是前2 條路線的緊密變體，在工藝中采用鈀催化實(shí)現(xiàn)C-N 交叉耦合取代路線1 和路線2 中的SN2 取代反應(yīng)，從而提高了該步驟的收率。該工藝在成品純化因得到的中間體頭孢洛扎三氟乙酸鹽純度高，從而規(guī)避了樹脂純化和納濾濃縮操作，相對(duì)于路線1 和路線2 簡化了后處理純化操作過程，主要的缺點(diǎn)是該工藝路線步驟使用了成本較高的鈀催化劑和與之配位的膦配體，但使用量可以持續(xù)優(yōu)化，整條路線相對(duì)于路線1 和路線2 反應(yīng)步驟短，工藝易于操作且收率高從而降低了生產(chǎn)成本。所以第3 條合成路線更具優(yōu)勢(shì)。

5 抗菌藥物研發(fā)展望及頭孢洛扎工藝研究結(jié)論

頭孢菌素藥物發(fā)展經(jīng)由歷史輝煌轉(zhuǎn)而研發(fā)遲緩進(jìn)而到現(xiàn)在全球積極推進(jìn)新的抗菌藥物管線研發(fā)并取得一系列積極成果。對(duì)于最新“代”的頭孢菌素藥物：頭孢洛扎，在近年來生產(chǎn)工藝及技術(shù)也有了較大的發(fā)展。文獻(xiàn)及專利中主要報(bào)道了3 種最可能適合工業(yè)生產(chǎn)的路線。路線3 相對(duì)于路線1 和路線2 簡化了后處理純化操作過程，整條路線相對(duì)于路線1 和路線2步驟短，工藝易于操作且收率高從而明顯降低了生產(chǎn)成本，該工藝路線更具優(yōu)勢(shì)和研究價(jià)值。頭孢洛扎作為第5 代頭孢菌素的典型代表，除了原研廠家，國內(nèi)暫未有企業(yè)申請(qǐng)上市銷售。對(duì)頭孢菌素藥物發(fā)展介紹和對(duì)頭孢洛扎工藝合成路線研究對(duì)后期頭孢洛扎在我國的發(fā)展具有重要參考價(jià)值。研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)可結(jié)合自身生產(chǎn)條件參考以上3 條路線進(jìn)行開發(fā)改進(jìn)，得到一條適合生產(chǎn)企業(yè)條件的，能穩(wěn)定生產(chǎn)的綠色工藝路線，為頭孢洛扎的進(jìn)一步研究發(fā)展提供支撐。