周淑萍,盛曉曼

(1.安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 淮南 232001;2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,安徽 淮南 232001)

胃癌(gastric cancer,GC)是中國最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2020年的數(shù)據(jù)分析顯示,在中國胃癌的發(fā)病率占所有癌癥發(fā)病率的10%,僅次于肝癌和結(jié)直腸癌;在所有癌癥中,胃癌的死亡率排第3位,僅在肺癌和肝癌之后[1]。由于早期胃癌的癥狀并不典型,部分患者僅表現(xiàn)為腹痛、腹脹,因而并未引起重視,待到確診時病程已進(jìn)入進(jìn)展期。經(jīng)過及時治療,早期胃癌的5年生存率可達(dá)95%以上;但中晚期胃癌即便進(jìn)行了外科手術(shù),患者的中位生存時間仍舊不到1年[2]。因此,雖然近年來胃癌的診療技術(shù)有所提高,但胃癌仍是造成中國癌癥負(fù)擔(dān)的重要因素之一。

在胃癌診斷標(biāo)志物的研究中,常規(guī)用于臨床的生物標(biāo)志物有HER-2、CEA和CA19-9等,但這些標(biāo)志物在早期診斷方面仍缺乏足夠的特異性和敏感性[3]。在胃癌的治療中,雖然曲妥珠單抗、雷莫蘆單抗和阿帕替尼等藥物被批準(zhǔn)用于晚期胃癌的治療,但由于胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜和高度異質(zhì)性的特點(diǎn),使其靶向治療的作用有限[4]。因此,探索胃癌的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)有助于胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物、提高胃癌的早期診斷率并尋找新的治療靶點(diǎn)有非常重要的意義。

有研究表明糖酵解在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,由于腫瘤細(xì)胞的繁殖十分迅速,使其即使處在正常的氧氣濃度下依然會消耗葡萄糖產(chǎn)生大量乳酸,這種現(xiàn)象被稱作“Warburg效應(yīng)”或“有氧糖酵解”[5]。M2型丙酮酸激酶[6](M2 isoform of pyruvate kinase,PKM2)和醛縮酶A[7](transcriptional levels of aldolase A,ALDOA)與糖酵解關(guān)系密切,并在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá),可作為新的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷中發(fā)揮一定作用。本研究采用免疫組化技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)檢測胃癌細(xì)胞中PKM2和ALDOA的表達(dá)情況,并與胃癌組織的病理特征進(jìn)行對比分析,探索其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用,以期為臨床上胃癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究以2020年至2022年間于安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外三科行胃癌根治術(shù)的30例患者為研究對象。所有患者均術(shù)后均對手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行病理活檢,并進(jìn)行TNM分期,確保獲得完整的臨床病理數(shù)據(jù)。納入與排除標(biāo)準(zhǔn)如下,納入標(biāo)準(zhǔn):①病理活檢確診為胃癌;②圍手術(shù)期內(nèi)未出現(xiàn)死亡事件;③所有病例手術(shù)前均未接受過任何放射及化學(xué)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①臨床資料不完整;②合并其他惡性腫瘤;③合并其他嚴(yán)重疾病。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測

胃癌組織中PKM2和ALDOA的表達(dá)用免疫組織化學(xué)法檢測:①將切片脫蠟至水化;②抗原修復(fù);③用3%的過氧化氫水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;④血清封閉30min;⑤甩掉封閉液,滴加1∶200比例稀釋PKM2一抗(貨號bs-0101R,購自bioss)或者ALDOA一抗(貨號BS-2406R,購自bioss),置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜;⑥加入1∶200比例稀釋的二抗(HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG,貨號GB23303,購自Servicebio);⑦用DAB顯色液對其染色;⑧用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核;⑨經(jīng)脫水封片后置于白光顯微鏡下進(jìn)行結(jié)果分析。細(xì)胞核經(jīng)蘇木素染色后呈藍(lán)色,PKM2和ALDOA經(jīng)DAB顯色后均為棕黃色。

1.3 評分標(biāo)準(zhǔn)

每張完成染色的標(biāo)本切片交予兩名高年資病理專家于200倍鏡下對細(xì)胞染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽性率進(jìn)行判讀。細(xì)胞染色強(qiáng)度判定:胞質(zhì)無著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分;細(xì)胞陽性率判定:0～5%判為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、≥76%為4分。最終得分以細(xì)胞陽性率(0～4分)與染色程度(0～3分)的分值相乘,0分為(-)、1～4分為(-/+)、5～8分為(+)、9～12分為(++),其中以(++)為其在胃癌組織中高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 受試者基本特征

納入研究的30名受試者其中,男性16例,女性14例;年齡≤60歲的患者6例,>60歲的24例,平均年齡為(68.77±8.25)歲;腫瘤浸潤深度:T1～T2的有10例,T3～T4的有20例;有/無淋巴轉(zhuǎn)移的有10/20例;早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者13例,晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者17例;腫瘤最大直徑:<5cm的有18例,≥5cm的有12例;低分化患者14例,中/高分化患者16例;血管侵犯有/無分別為20例、10例,神經(jīng)侵犯有/無分別為12例、18例。

2.2 PKM2和ALDOA在胃癌中的表達(dá)

PKM2主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),DAB染色呈彌漫的棕褐色。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色程度和細(xì)胞陽性率對PKM2的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行判定。如圖1(a)所示PKM2的表達(dá)強(qiáng)度為“-”,圖1(b)表示PKM2的表達(dá)強(qiáng)度為“-/+”,圖1(c)表示PKM2的表達(dá)強(qiáng)度為“+”,圖1(d)表示PKM2的表達(dá)強(qiáng)度為“++”。

圖1 PKM2在胃癌組織中的表達(dá)(×200)

ALDOA同樣在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),免疫組化DAB顯色及結(jié)果判定與PKM2相同。如圖2(a)所示ALDOA的表達(dá)強(qiáng)度為“-”,圖2(b)表示ALDOA的表達(dá)強(qiáng)度為“-/+”,圖2(c)表示ALDOA的表達(dá)強(qiáng)度為“+”,圖2(d)表示ALDOA的表達(dá)強(qiáng)度為“++”。

圖2 ALDOA在胃癌組織中的表達(dá)(×200)

如圖3所示,在胃癌組織中,PKM2高表達(dá)17例,低表達(dá)13例,高表達(dá)率為57%;ALDOA高表達(dá)18例,低表達(dá)12例,高表達(dá)率為60%。

圖3 PKM2和ALDOA的陽性表達(dá)數(shù)

2.3 PKM2的表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系

如表1所示,浸潤深度為T1～T2的胃癌組織中PKM2的高表達(dá)率為20%(2/10),低于T3～T4組的75%(15/20);TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的胃癌組織中PKM2高表達(dá)率為31%(4/13),低于Ⅲ～Ⅳ期的76%(13/17);低分化組中PKM2的高表達(dá)率為29%(4/14),低于中/高分化組的81%(13/16);PKM2的表達(dá)與胃癌組織的浸潤深度、TNM分期及分化程度具有相關(guān)性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而其他因素如性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)和血管侵犯,與PKM2的表達(dá)未見明顯相關(guān)(P>0.05)。

表1 PKM2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ALDOA的表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系

如表2所示,浸潤深度為T1～T2的胃癌組織中ALDOA的高表達(dá)率為30%(3/10),低于T3～T4組的75%(15/20);低分化組中ALDOA的高表達(dá)率為36%(5/14),低于中/高分化組的81%(13/16);ALDOA的表達(dá)與胃癌組織的浸潤深度和分化程度具有相關(guān)性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他因素如性別、年齡、有無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大小和有無神經(jīng)、血管侵犯,與ALDOA的表達(dá)未見明顯相關(guān)(P>0.05)。

表2 ALDOA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是造成患者死亡的主要原因,這種惡性生物學(xué)行為需要大量的能量支持,其中糖代謝是腫瘤細(xì)胞最主要的供能方式之一。由于腫瘤的快速增長,即便在正常氧氣濃度下,腫瘤細(xì)胞也始終處在一種微缺氧狀態(tài),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的供能方式從氧化磷酸化轉(zhuǎn)為糖酵解。這種適應(yīng)性反應(yīng)被稱為“Warburg效應(yīng)”或“有氧糖酵解”。因此,作用于糖酵解途徑中的酶可能會在癌癥組織中受到調(diào)控[8]。丙酮酸激酶作用于糖酵解途徑,可催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP反應(yīng)并產(chǎn)生丙酮酸和ATP。其中PKM2常在一些需大量增殖的細(xì)胞和大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。PKM2有兩種表現(xiàn)形式:一種是主要作用于有氧氧化的高活性四聚體,另一種是有利于有氧糖酵解的低活性二聚體[9-10]。這兩種形式表現(xiàn)出來的動態(tài)平衡可使腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)不足的環(huán)境下調(diào)節(jié)自身合成和營養(yǎng)代謝,從而起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。除了與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)外,PKM2的過表達(dá)還可以反應(yīng)腫瘤的預(yù)后。與正常組織相比,PKM2在腫瘤組織中的mRNA和蛋白質(zhì)水平都過表達(dá),并且PKM2蛋白的表達(dá)和胃癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān),從而PKM2的表達(dá)可以被認(rèn)為是胃印戒細(xì)胞癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一[11]。文獻(xiàn)[12]的研究進(jìn)一步表明了PKM2的高表達(dá)對維持GC細(xì)胞的惡性表型起著重要作用,抑制PKM2依賴性的糖酵解可能成為胃癌治療的新方向。本研究應(yīng)用IHC技術(shù)對胃癌患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),30例胃癌組織標(biāo)本中,PKM2高表達(dá)的有17例,其高表達(dá)率為57%。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)PKM2的表達(dá)與胃癌組織的浸潤深度、TNM分期以及分化程度有關(guān),即PKM2的表達(dá)率隨著病情的推進(jìn)而升高,與之前的研究結(jié)果相符。

ALDOA作為一種調(diào)節(jié)酶,不僅參與糖酵解,還參與調(diào)節(jié)糖異生[13]。糖酵解和糖異生都可為腫瘤細(xì)胞的增殖提供能量,越來越多的研究證明ALDOA在幾種癌癥的病理進(jìn)展中也起著重要作用。文獻(xiàn)[14]研究發(fā)現(xiàn)ALDOA在子宮頸宮頸腺癌中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管浸潤還有總生存期短相關(guān),而ALDOA的表達(dá)被抑制后則明顯降低了宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲性。文獻(xiàn)[15]對肝內(nèi)膽管癌的研究得出,ALDOA高表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)ALDOA介導(dǎo)的糖酵解增強(qiáng)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的因素之一。上述結(jié)果在肺癌[16]、肝癌[17]和腎癌[18]的研究中均能得到驗(yàn)證。本研究顯示,在30例胃癌組織標(biāo)本中,ALDOA高表達(dá)的有18例,其高表達(dá)率為60%,并且與胃癌組織的浸潤深度和分化程度具有相關(guān)性,即ALDOA的表達(dá)同樣隨著胃癌病情的進(jìn)展而增加。本研究所得結(jié)果與ALDOA在其他多種癌癥中的表達(dá)情況一致,提示ALDOA同樣促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展,可以為胃癌診斷和治療提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)PKM2和ALDOA的表達(dá)是隨著疾病的進(jìn)展而增加,表明作為糖酵解調(diào)節(jié)酶的PKM2和ALDOA或許可通過增強(qiáng)供能在腫瘤的生長過程中發(fā)揮著重要作用,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展;而抑制PKM2和ALDOA的表達(dá)、阻斷二者的作用途徑,或許可以作為胃癌治療的新靶點(diǎn)。TNM分期是影響腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素,本研究發(fā)現(xiàn)PKM2和ALDOA的表達(dá)與TNM的分期具有相關(guān)性,這表明通過檢測PKM2和ALDOA的表達(dá)強(qiáng)度有助于判斷病人預(yù)后及危重程度,從而制定最佳的治療方案。

4 結(jié)論

本研究顯示,PKM2和ALDOA在胃癌組織中均存在高表達(dá),并且與疾病的進(jìn)展存在相關(guān)性。這表明胃癌組織中可能存在通過增強(qiáng)糖酵解來促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,因此阻斷PKM2和ALDOA、抑制糖酵解或許會為胃癌的治療指明新方向。之前的研究認(rèn)為,癌癥的TNM分期與疾病的預(yù)后緊密相關(guān)。本研究得出PKM2和ALDOA的高表達(dá)與腫瘤的浸潤、TNM分期明顯相關(guān),因而推測這兩種酶或許可以作為胃癌發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志物,并借此來估計(jì)胃癌的預(yù)后。

本研究樣本量較小,所得的結(jié)果可能存在偏差,還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以證實(shí)上述結(jié)果。考慮到手術(shù)病理切片的獲取過程相對繁雜,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可從胃癌患者的血清著手,研究PKM2和ALDOA在血清和組織切片中是否是相同的表達(dá)模式,為開發(fā)新的血清學(xué)胃癌標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)。